Rilevamento e isolamento di Campylobacter spp. da carne cruda

Summary

Il Campylobacter è la principale causa di gastroenterite batterica di origine alimentare in tutto il mondo. Nonostante gli stabilimenti adottino misure per ridurre la prevalenza in tutte le loro strutture, i prodotti contaminati raggiungono costantemente i consumatori. La tecnica sviluppata negli ultimi dodici anni affronta i limiti dei metodi esistenti per isolare e rilevare Campylobacter spp. dalla carne cruda.

Abstract

Questo articolo presenta un protocollo rapido ma robusto per isolare Campylobacter spp. dalle carni crude, concentrandosi in particolare su Campylobacter jejuni e Campylobacter coli. Il protocollo si basa su metodi consolidati, garantendo la compatibilità con le tecniche prevalenti impiegate da organismi di regolamentazione come la Food and Drug Administration (FDA) e il Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) negli Stati Uniti, nonché l’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) in Europa. Al centro di questo protocollo c’è la raccolta di un risciacquo, che viene concentrato e risospeso in un terreno di brodo Bolton contenente sangue di cavallo. È stato dimostrato che questo terreno facilita il recupero delle cellule stressate di Campylobacter e riduce la durata dell’arricchimento richiesto del 50%. I campioni arricchiti vengono poi trasferiti su membrane di nitrocellulosa su piastre di brucella. Per migliorare la sensibilità e la specificità del metodo, sono state valutate membrane filtranti di dimensioni dei pori da 0,45 μm e 0,65 μm. I dati hanno rivelato un aumento di 29 volte del recupero cellulare con il filtro di dimensioni dei pori di 0,65 μm rispetto alla dimensione dei pori di 0,45 μm, senza influire sulla specificità. Le caratteristiche altamente mobili di Campylobacter consentono alle cellule di muoversi attivamente attraverso i filtri di membrana verso il terreno di agar, il che consente un efficace isolamento delle colonie di Campylobacter puro. Il protocollo incorpora il test di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale multiplex (mqPCR) per identificare gli isolati a livello di specie. Questa tecnica molecolare offre un mezzo affidabile ed efficiente per l’identificazione delle specie. Le indagini condotte negli ultimi dodici anni che hanno coinvolto le carni al dettaglio hanno dimostrato la capacità di questo metodo di migliorare il recupero di Campylobacter da campioni di carne naturalmente contaminati rispetto agli attuali metodi di riferimento. Inoltre, questo protocollo vanta tempi di preparazione e lavorazione ridotti. Di conseguenza, rappresenta un’alternativa promettente per il recupero efficiente del Campylobacter dalla carne. Inoltre, questa procedura può essere perfettamente integrata con metodi basati sul DNA, facilitando lo screening rapido dei campioni positivi insieme all’analisi completa del sequenziamento dell’intero genoma.

Introduction

Campylobacter spp. è la principale causa di gastroenterite batterica di origine alimentare in tutto il mondo, con una stima di 800 milioni di casi all’anno¹. Essendo uno dei principali batteri zoonotici, il Campylobacter colonizza naturalmente il tratto gastrointestinale di un’ampia gamma di animali, tra cui uccelli selvatici, animali da fattoria e animali domestici². Durante la macellazione o la lavorazione degli alimenti, Campylobacter spp. contamina frequentemente le carcasse o i prodotti a base di carne³. La campilobatteriosi è solitamente associata al consumo di pollame poco cotto o alla contaminazione incrociata di altri alimenti da parte di succhi di pollame crudi². Può causare gravi complicanze, come la sindrome di Guillain-Barré, l’artrite reattiva e la setticemia in individui immunocompromessi⁴. Rilevare e isolare il Campylobacter da fonti alimentari, in particolare dai prodotti a base di pollame, è essenziale per la sorveglianza della salute pubblica, l’indagine sui focolai e la valutazione del rischio.

I metodi convenzionali basati sulla coltura sono i metodi tradizionali e standard per la rilevazione di Campylobacter ^5,6. Tuttavia, ci sono diverse limitazioni, tra cui lunghi tempi di incubazione (48 ore o più), bassa sensibilità (fino al 50%) e non sono inclusivi per tutti i ceppi (alcune cellule di Campylobacter stressate potrebbero non crescere bene o non crescere affatto nei terreni)⁷. I metodi molecolari, come la reazione a catena della polimerasi (PCR), sono più rapidi e sensibili rispetto ai metodi basati sulla coltura, ma non forniscono isolati vitali per un’ulteriore caratterizzazione ^8,9.

I metodi immunologici sono metodi alternativi e complementari per la rilevazione del Campylobacter . Questi sono rapidi, semplici e versatili, ma hanno anche diverse limitazioni, tra cui la cross-reattività (alcuni anticorpi possono legarsi a batteri non Campylobacter o ad altre sostanze che condividono antigeni simili), la bassa specificità (alcuni anticorpi potrebbero non legarsi a tutti i ceppi o sierotipi di Campylobacter ) e i requisiti di preparazione del campione (i metodi immunologici spesso richiedono un pretrattamento dei campioni per rimuovere le sostanze interferenti per migliorare il legame degli anticorpi)¹⁰A questo punto,

All’interno del genere Campylobacter, C. jejuni e C. coli causano la maggior parte delle infezioni umane da Campylobacter (rispettivamente 81% e 8,4%⁾¹¹. Entrambi sono batteri a forma di spirale, microaerofili e termofili contenenti un flagello unipolare o flagelli bipolari. La rotazione di un flagello ad ogni polo è considerata sia la forza motrice primaria per la sua caratteristica motilità a cavatappi sia cruciale per la sua patogenesi perché consente al batterio di nuotare attraverso la mucosa viscosa del tratto gastrointestinale ospite. La motilità di Campylobacter è controllata dal suo sistema chemiosensoriale che consente alle cellule di spostarsi verso ambienti favorevoli^12,13. Sulla base della morfologia cellulare e delle caratteristiche fisiologiche di Campylobacter, alcuni studi hanno utilizzato la filtrazione a membrana per l’isolamento di Campylobacter spp. da campioni fecali e ambientali 14,15,16.

Questo studio presenta un protocollo rapido e robusto per l’isolamento e la successiva rilevazione di C. jejuni e C. coli dalla carne cruda, che supera gli inconvenienti dei metodi esistenti e offre diversi vantaggi. Le colonie sperimentali possono essere confermate come Campylobacter spp. utilizzando una varietà di metodi, come microscopia, test biochimici (ad esempio, saggi di attività della catalasi e dell’ossidasi) o metodi molecolari⁶. Il metodo identifica gli isolati a livello di specie utilizzando un test multiplex real-time PCR (mqPCR) che prende di mira geni unici per C. jejuni e C. coli. Questo metodo è relativamente economico, rapido e selettivo, il che lo rende adatto per l’uso in una varietà di ambienti, inclusi impianti di lavorazione degli alimenti, laboratori clinici e laboratori di ricerca.

Protocol

Tutto il lavoro associato a questo protocollo deve essere condotto all’interno di una cabina di sicurezza biologica (BSC) per mantenere condizioni asettiche e ridurre al minimo il rischio di contaminazione del campione o l’esposizione dell’operatore a patogeni microbici. Quando si trasferiscono i campioni al di fuori del BSC, utilizzare contenitori sigillati per evitare fuoriuscite in caso di cadute accidentali, mantenendo l’integrità del campione. Preferibilmente, i componenti monouso devono essere utilizzati durante tutta la procedura per mitigare la possibilità di contaminazione incrociata. Nei casi in cui i prodotti usa e getta non sono fattibili, assicurarsi che tutte le attrezzature e i materiali siano sterili prima dell’uso. Una corretta gestione dei rifiuti è fondamentale; Tutti i componenti usa e getta usati devono essere smaltiti come rifiuti a rischio biologico. Autoclavare i materiali prima dello smaltimento per garantire una corretta sterilizzazione ed evitare il contenimento di materiali potenzialmente pericolosi. Il rispetto di queste precauzioni non solo salvaguarda l’integrità del campione, ma riduce anche al minimo il rischio di esposizione dell’operatore a patogeni microbici. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro della preparazione del campione, dell’arricchimento selettivo, dell’isolamento basato su filtri e della differenziazione mqPCR delle specie di Campylobacter . Il file supplementare 1 illustra un flusso di lavoro e immagini più dettagliate durante tutto il processo. 1. Preparazione dei campioni di carne Acquisizione di campioni di carneAcquista varie confezioni di carne fresca, tra cui cosce di pollo, ali, cosce e fegatini dai rivenditori locali. Trasferire tutti i campioni in conservazione a 4 °C ed elaborare entro 24 ore dal ricevimento.NOTA: La conservazione dei campioni freschi a temperature più basse, ad esempio al di sotto dello zero, influirà sul recupero. Lavorazione di campioni di carneSeguire il rapporto dei componenti prescritto all’interno delle linee guida di campionamento FSIS 6,17. Tagliare 450 g di pezzi di pollo da ogni confezione e metterli in un sacchetto stomacher (vedi Tabella dei materiali).NOTA: I sacchetti Stomacher sono consigliati perché hanno una resistenza meccanica sufficiente per garantire i processi a valle e non si rompono o perdono. Preparare l’acqua peptonica tamponata (BPW).Sciogliere 20 g di polvere (vedi Tabella dei materiali) in 1 L di acqua purificata. Autoclavare la soluzione a 121 °C per 15 min. Diluire la soluzione in acqua sterile ad una concentrazione dello 0,1%. Aggiungere 200 ml di BPW allo 0,1% nella sacca stomacher contenente il pollo. Massaggiare/palpare manualmente il campione dall’esterno della sacca stomacher per 2 minuti. Raccogliere tutto il risciacquo del pollo dal lato filtrato del sacchetto utilizzando un controller per pipette motorizzato (vedere la tabella dei materiali). Erogare il risciacquo del pollo in flaconi sterili da centrifuga. Centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere con cura il surnatante utilizzando un controller per pipette motorizzato con una pipetta di plastica sierologica monouso da 25 mL. Evitare di disturbare il pellet. Ripetere il processo se necessario per assicurarsi che tutto il surnatante sia stato rimosso. Scartare il surnatante raccolto. 2. Arricchimento selettivo di Campylobacter da carne cruda Preparazione del Brodo Bolton con integratoriSciogliere 13,8 g di polvere (vedi Tabella dei materiali) in 500 mL di acqua purificata. Sterilizzare il brodo in autoclave per 15 minuti a 121 °C. Aggiungere 25 ml di sangue di cavallo lacerato (vedi tabella dei materiali) al brodo Bolton sterilizzato da 500 ml.NOTA: L’aggiunta di sangue di cavallo agisce come agente estinguente dell’ossigeno per aiutare nel recupero delle cellule di Campylobacter danneggiate dalla matrice alimentare. Ricostituire 1 flaconcino di integratore antibiotico (cefoperazone, cicloesimide, trimetoprim e vancomicina, vedere Tabella dei materiali) in 5 mL di etanolo al 50%. Aggiungere l’integratore antibiotico ricostituito al Brodo Bolton. Procedura di arricchimentoRisospendere il pellet in 50 ml di brodo Bolton contenente sangue di cavallo lacerato e antibiotici. Collocare i campioni (con i tappi allentati) all’interno di un contenitore sigillato che mantenga una miscela di gas dell’85% di N2, del 10% di CO2 e del 5% di O2 .Assicurarsi che il tappo sia allentato, ma che il contenitore sia ben sigillato per produrre i requisiti di crescita microaerofila e termofila di Campylobacter.NOTA: I pacchetti di gas che mantengono un’atmosfera dell’85% di N2, del 10% di CO2 e del 5% di O2 possono essere utilizzati quando non sono disponibili camere ambientali. Incubare i campioni a 42 °C per 24 ore. 3. Isolamento e purificazione di C. jejuni e C. coli da pollo crudo Preparazione delle piastre di agar BrucellaSciogliere 28 g di polvere di Brucella (vedi Tabella dei Materiali) in 1 L di acqua purificata. Sciogliere 15 g di agar nella soluzione di Brucella. Sterilizzare l’agar Brucella in autoclave per 15 minuti a 121 °C. Raffreddare la miscela mediamente agar a bagnomaria a 55 °C. Versare 20 ml di agar Brucella in ogni capsula di Petri di 100 mm di diametro. Metodo di filtraggio e coltivazione di colonieValutare l’effetto dell’umidità sul passaggio di Campylobacter attraverso i filtri essiccando piastre di agar Brucella con coperchi aperti in una cabina di sicurezza biologica per 0 h, 1 h, 2 h e 3 h. Preparare un controllo senza filtro distribuendo direttamente 80 μL del campione sulla piastra di agar Brucella. Posizionare un filtro in acetato di cellulosa (0,45 μm o 0,65 pori, vedere la tabella dei materiali) al centro di una piastra di agar Brucella. Pipettare 4 gocce/filtro e 20 μL/goccia di campione arricchito sul filtro.Posizionare le gocce vicino al centro del filtro per assicurarsi che il liquido che raggiunge la piastra passi attraverso il filtro, non intorno al filtro. Posiziona le gocce in modo che non si diffondano e non si aggreghino. Incubare le gocce a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere con cura i filtri.NOTA: Questo passaggio consente alle cellule di Campylobacter di avere un tempo sufficiente per attraversare la membrana e raggiungere il terreno di agar senza un’eccessiva essiccazione. Incubare le piastre a 42 °C per circa 24 ore nelle condizioni microaerobiche descritte in precedenza. Scegli le colonie di Campylobacter caratteristiche con tratti specifici.NOTA: Le colonie di Campylobacter sono tipicamente rotonde con bordi lisci, luccicanti e di colore giallastro o rosato traslucido6. Striare le colonie su piastre di agar Brucella per la purificazione. Ripetere questo passaggio fino ad ottenere piastre con un’unica morfologia uniforme della colonia. Preparare i campioni per la conservazione a lungo termine.Preparare il brodo di Bolton come descritto in precedenza. Aggiungere una colonia dalla piastra con morfologia uniforme della colonia. Coltiva durante la notte (24 h) nelle condizioni microaerofile descritte in precedenza. Aggiungere 900 μL della coltura notturna a un crioviale da 2 mL contenente 100 μL di DMSO. Raffreddare rapidamente in un bagno di ghiaccio secco ed etanolo (ca. -72 °C) per 10 min. Trasferire in un congelatore a -80 °C per la conservazione a lungo termine. 4. Identificazione delle specie di C. jejuni e C. coli Eseguire l’identificazione a livello di specie di C. jejuni e C. coli utilizzando un test qPCR multiplex (mqPCR) precedentemente sviluppato18,19.Eseguite la lisi cellulare rapida e l’estrazione del DNA genomico in un formato di piastra a 96 pozzetti.NOTA: Si raccomanda vivamente di prendere in considerazione l’utilizzo di kit commerciali (vedere la tabella dei materiali) per garantire che il campione sia sufficientemente privo di inibitori noti della PCR.Disperdere le colonie di Campylobacter purificate in 100 μL di soluzione di estrazione. Lisare i campioni a 99 °C per 10 minuti, quindi raffreddarli a 20 °C per 2 minuti in un termociclatore. Centrifugare la piastra a 8.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere 2 μL di aliquote del surnatante per il test mqPCR. Preparare una miscela di reazione da 20 μL composta da 10 μL di 2x Master Mix, 2,0 μL di campione di DNA, 104 copie di Internal Amplification Control (IAC) e 200 nM di ciascun primer e sonda (vedere la tabella dei materiali).NOTA: I primer e le sonde di hipO e cdtA sono i geni bersaglio esclusivi rispettivamente per C. jejuni e C. coli. L’IAC è costituito da un segmento di DNA di 79 bp dell’adenovirus umano ed è incluso come controllo positivo per garantire un’attività coerente della DNA polimerasi in tutti i campioni. Caricare tutti i campioni in triplice copia in una piastra ottica a 96 pozzetti ricoperta da una pellicola ottica e inserirli in un sistema di PCR in tempo reale (vedere la tabella dei materiali).Avviare un’attivazione a caldo della DNA polimerasi a 95 °C per 10 minuti. Proseguire con 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s e ricottura/estensione a 60 °C per 1 min. 5. Enumerare le sospensioni cellulari Enumerare le sospensioni cellulari utilizzando una procedura con piastra a goccia 6 x 620. Fare riferimento al file supplementare 1 per le immagini che raffigurano il metodo della piastra di caduta 6 x 6. Essiccare all’aria le piastre di agar Brucella con il coperchio in una cappa a flusso laminare per 45 min. Aggiungere 200 μL di sospensione batterica a sei file (A-F) nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti. Distribuire 180 μL di terreno Brucella su sei file delle colonne rimanenti (2-12). Preparare diluizioni seriali dieci volte superiori utilizzando trasferimenti da 20 μL.Ad esempio, trasferire 20 μL di campione dalla prima alla seconda colonna. Ripeti questo processo per un minimo di 6 colonne. Miscelare a reflusso ogni sospensione dieci volte utilizzando la pipetta, cambiando i puntali tra un trasferimento e l’altro. Utilizzare una pipetta multicanale per depositare gocce da 7 μL da sei file di una colonna sulla superficie di una piastra di agar Brucella. Ripetere l’operazione per creare una matrice 6 x 6, assicurandosi che le righe siano repliche tecniche tra le colonne. Asciugare le piastre all’aria per 5 minuti, quindi capovolgere la piastra. Incubare le piastre a 42 °C per 24 ore. Contare il numero di colonie in ciascuna diluizione rappresentativa.

Representative Results

Effetto dell’umidità nelle piastre di agar Brucella per la filtrazione passiva di CampylobacterCampylobacter ha un genoma piccolo e manca di diversi geni di risposta allo stress che si verificano comunemente in altri batteri, come E. coli O157:H7 e Salmonella. Pertanto, è più sensibile a vari stress ambientali e non tollera la disidratazione o i livelli di ossigeno ambientale. Al contrario, un terreno di agar eccessivamente umido può allagare il filtro. Ciò non solo provoca la diffusione del campione all’esterno del filtro, ma aumenta anche il tempo di esposizione all’ossigeno21. Per determinare le condizioni appropriate per l’isolamento di Campylobacter mediante filtro, le piastre di agar Brucella sono state essiccate con i coperchi rimossi per 0 ore, 1 ora, 2 ore e 3 ore all’interno di una cabina di sicurezza biologica e valutate l’efficienza delle cellule di Campylobacter nell’attraversare un filtro di dimensioni dei pori di 0,65 μm. Quattro aliquote da 20 μL di colture di C. jejuni S27 alle concentrazioni di 1,53 x 104 e 1,53 x 105 CFU/mL sono state pipettate su ciascuna membrana filtrante che era stata posizionata sopra una piastra Brucella. Dopo 15 minuti di penetrazione, i filtri sono stati rimossi e le piastre sono state incubate durante la notte per la crescita cellulare. Le cellule di 5 piastre replicate sono state quindi contate e annotate nella Tabella 1. I risultati hanno indicato che le piastre di agar essiccate per 2 ore e 3 ore si sono comportate in modo simile con un numero quasi uguale di cellule recuperate dalla filtrazione passiva. In particolare, le piastre essiccate in queste condizioni per 0 h e 1 h non hanno permesso alle cellule di attraversare completamente la membrana entro il periodo di tempo di 15 minuti utilizzato. Confronto tra membrane filtranti di diverse dimensioni dei pori per isolare Campylobacter dai fegatini di polloConsiderando le dimensioni delle cellule di Campylobacter (0,5-5 μm di lunghezza e 0,2-0,9 μm di larghezza) e un’ampia gamma di dimensioni delle particelle alimentari, i filtri in acetato di cellulosa con dimensioni dei pori di 0,45 μm e 0,65 μm sono stati testati per l’efficienza del passaggio di Campylobacter quando è stato dato un tempo di incubazione di 15 minuti. Per l’esperimento sono stati utilizzati campioni alimentari costituiti da 450 g di fegatini di pollo addizionati con 153 CFU di C. jejuni e poi arricchiti durante la notte. Come controllo senza filtro, è stata inclusa in parallelo la placcatura diretta del campione di arricchimento. I risultati (Figura 2) di 5 piastre replicate hanno mostrato in modo coerente che il filtro con dimensione dei pori di 0,65 μm ha permesso a più cellule di attraversare rispetto ai filtri con dimensioni dei pori da 0,45 μm, con conseguenti aumenti di ~29 volte più cellule ottenute. Il filtro con dimensione dei pori da 0,45 μm ha trattenuto troppe cellule sul lato superiore del filtro, con conseguente recupero significativamente inferiore di Campylobacter dagli alimenti rispetto al filtro con dimensione dei pori da 0,65 μm. Come previsto, c’era un prato di diversi organismi di fondo che crescevano sulle piastre di controllo senza filtro. Applicazione della filtrazione passiva nell’isolamento di Campylobacter da polli al dettaglioA causa dell’insolita motilità delle cellule di Campylobacter , la tecnica di filtrazione passiva è stata selezionata per l’isolamento di C. jejuni e C. coli da prodotti a base di carne al dettaglio, che sono tipicamente contaminati da numerosi organismi di fondo. Tra gli anni 2014-2023, un totale di 79 confezioni di carne cruda, tra cui diverse parti di carne di pollo, fegatini di pollo, fegatini di manzo e fegati di vitello, sono stati raccolti da vari supermercati locali. Da ciascuna confezione sono stati prelevati 450 g per l’isolamento di Campylobacter spp. Combinando l’arricchimento selettivo di Campylobacter in brodo di Bolton contenente sangue e la filtrazione passiva delle cellule attraverso un filtro in acetato di cellulosa di dimensioni dei pori di 0,65 μm direttamente su una piastra di agar Brucella, 49 ceppi di Campylobacter sono stati isolati con successo da 79 campioni di carne (Tabella 2). La Figura 3 rappresenta il risultato dell’isolamento di un nuovo ceppo di Campylobacter da fegatini di pollo. Il metodo ha ripetutamente dimostrato di essere sensibile, specifico ed economico. Identificazione e differenziazione degli isolati di C. jejuni e C. coliPer verificare il genere e differenziare le specie di isolati di Campylobacter ottenuti da carne cruda, è stato utilizzato un test qPCR multiplex che amplifica i bersagli genici specifici (hipO e cdtA) per C. jejuni e C. coli, ed è stato utilizzato un controllo di amplificazione interna (IAC). L’IAC è stato incluso come indicatore falso-negativo nell’amplificazione simultanea di più geni. Il test è stato implementato in un formato a 96 pozzetti con lisi cellulare rapida ed estrazione del DNA utilizzando un reagente disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). La tabella 2 riassume il risultato dell’identificazione delle specie dei ceppi di C. jejuni e C. coli . Come ulteriore verifica, i risultati del sequenziamento dell’intero genoma hanno confermato la specie di tutti gli isolati (dati non mostrati). Figura 1: Un diagramma del flusso di lavoro per l’isolamento e l’identificazione delle specie di Campylobacter dalla carne al dettaglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: L’impatto delle dimensioni del filtro sul recupero di Campylobacter. I risultati indicano che il filtro da 0,65 μm può recuperare in media 900 ± 138 colonie, mentre il filtro da 0,45 μm recupera 31 ± 7 colonie. I risultati sono stati generati da N = 20 (5 piastre con 4 gocce/piastra) e un test t di Student indica che le medie sono statisticamente diverse (p < 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Isolamento di Campylobacter mediante filtrazione passiva di campioni di pollame arricchito. (A) Raffigura le quattro gocce da 20 μL di campione arricchito depositate sul filtro a membrana di nitrocellulosa. L’immagine è stata raccolta durante i 15 minuti di filtrazione passiva. (B) Raffigura la targhetta dopo la rimozione del filtro in nitrocellulosa. I quattro punti indicano il punto in cui il campione arricchito ha attraversato la membrana. (C) Raffigura la piastra dopo 24 ore di incubazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: L’effetto del tempo di essiccazione delle piastre di agar Brucella sulla filtrazione passiva di C. jejuni. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: ceppi di C. jejuni e C. coli isolati da carne cruda. Durante il periodo di tempo che va dal 2008 al 2023, sono stati isolati 36 ceppi di C. jejuni e 13 ceppi di C. coli da 79 confezioni di carne in 24 prodotti al dettaglio unici. Clicca qui per scaricare questa tabella. File supplementare 1: immagini durante i processi di isolamento ed enumerazione. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Significato del protocollo
C. jejuni e C. coli sono state le due principali specie di Campylobacter risultate prevalenti nel pollame²² e nel fegato animale^23,24. In questo studio, i campioni di carne di parti di pollo (zampe, ali e cosce), fegatini di pollo e fegati di manzo sono stati raccolti in modo casuale durante diversi periodi di tempo e da diversi negozi al dettaglio e produttori per l’isolamento di Campylobacter spp. Dei 49 ceppi totali di Campylobacter isolati, 36 sono stati identificati come C. jejuni e 13 erano C. coli, senza altre specie di Campylobacter trovate, il che è coerente con altri rapporti²⁵.

Il test si basa sulla morfologia cellulare a forma di spirale e sulla caratteristica motilità a cavatappi di Campylobacter spp. Una semplice, ma efficace, tecnica di filtrazione passiva^26,27 che sfruttava la sua morfologia cellulare a forma di spirale (lunga, sottile, 0,2-0,9 per 0,5-5 μm) e la forte motilità del cavatappi è stata utilizzata per separare Campylobacter da una miscela di organismi di fondo. L’elevata motilità di Campylobacter ha permesso alle cellule di attraversare i filtri di membrana e di muoversi verso le condizioni favorevoli che si trovano all’interno del terreno di agar, mentre altri microrganismi di fondo dei prodotti a base di carne non sono stati in grado di passare. Questo metodo è relativamente economico, rapido e selettivo, il che lo rende adatto per l’uso in una varietà di ambienti, inclusi impianti di lavorazione degli alimenti, laboratori clinici e laboratori di ricerca.

Un articolo pionieristico spesso citato afferma che il filtro da 0,45 μm ha funzionato così bene che 0,65 μm non sono stati valutati²⁸. I risultati di questo studio indicano che il filtro con dimensione dei pori da 0,65 μm ha funzionato significativamente meglio rispetto alla dimensione dei pori da 0,45 μm, con un conseguente aumento di 29 volte del numero di cellule recuperate dall’arricchimento. Questo è importante perché i filtri selezionati non mostrano una selettività ridotta come riportato in precedenza²⁹. Inoltre, poiché è noto che la filtrazione ridurrà significativamente la quantità di Campylobacter recuperata rispetto alla placcatura diretta³⁰, pertanto, l’aumento delle dimensioni del poro migliora il recupero del microrganismo, il che è coerente con i risultati precedentemente riportati²¹. Ciò è significativo perché tutte le cellule che hanno attraversato i filtri hanno formato colonie uniformi di Campylobacter , indicando che entrambi i filtri erano sufficienti per impedire il passaggio di altre microflora e particelle di cibo. Inoltre, il diagramma di flusso^{FSIS 7} rileva il potenziale per la produzione di risultati estesi a causa della ri-striatura degli isolati su piastre Campy-Cefex contenenti antibiotici. Al contrario, il protocollo descritto in questo manoscritto, che combina l’uso della filtrazione e dell’arricchimento selettivo con cefoperazone, cicloesimide, trimetoprim e vancomicina, non ha richiesto la ricreazione di striature.

L’attuale metodo utilizzato è coerente con gli attuali programmi di campionamento e verifica FSIS¹⁷. Poiché il livello di contaminazione da Campylobacter può essere basso (153 CFU/450 g di pollo), il risciacquo viene centrifugato per concentrare il campione di un fattore quattro, il che aumenta la sensibilità del saggio. Dopo aver concentrato il risciacquo di un fattore 4x, i campioni vengono arricchiti per 48 ore e sottoposti a screening con il Molecular Detection System (MDS) per replicare il metodo impiegato dai laboratori FSIS (dati non mostrati). In particolare, il metodo descritto non è ancora riuscito a identificare i ceppi positivi entro 24 ore che sono stati rilevati dal sistema di rilevamento molecolare utilizzando 48 ore di arricchimento (dati non mostrati). Infine, un ulteriore vantaggio di questo protocollo è che può fornire informazioni relative alle specie batteriche e identificare se il Campylobacter è C.coli, C. jejuni o C. lari, mentre la MDS adottata in MLG 41.07 può fornire solo una risposta binaria positiva/negativa per Campylobacter.

Passaggi critici
Il protocollo per l’isolamento e l’identificazione di Campylobacter richiede precisione durante la centrifugazione, la filtrazione e l’analisi molecolare. Diluizioni accurate, condizioni di incubazione adeguate e un’aderenza meticolosa alle condizioni del test qPCR sono fondamentali per un’identificazione affidabile delle specie.

Essendo un batterio microaerofilo, il Campylobacter è molto fragile e sensibile a vari stress ambientali e richiede condizioni particolarmente particolari per la crescita 31,32,33. Nei campioni di cibo che in genere subiscono lunghi periodi di trasporto e conservazione, molte cellule di Campylobacter sono forse in dormienza o in uno stato di lesione subletale/letale^34,35. Pertanto, è importante recuperare le cellule stressate dalle loro matrici alimentari e farle crescere a una concentrazione più elevata. Nella prima fase della procedura, abbiamo utilizzato il brodo di Bolton integrato con sangue di cavallo lacerato e antibiotici per l’arricchimento selettivo di Campylobacter dal cibo. Il sangue aggiuntivo è servito come agente estinguente dell’ossigeno per superare gli effetti avversi dei radicali liberi dell’ossigeno³⁶. Gli antibiotici sono stati utilizzati per inibire la crescita della microflora di fondo³⁷.

Per ridurre al minimo il tempo di esposizione di Campylobacter all’ossigeno atmosferico ambientale, è stato selezionato un periodo di incubazione di 15 minuti per consentire alle cellule di attraversare il filtro. Inoltre, l’umidità della piastra di agar Brucella sotto il filtro ha svolto un ruolo importante nella velocità di passaggio. In particolare, i risultati dei test sulle piastre di agar essiccate per 0 h, 1 h, 2 h e 3 h hanno suggerito che un alto contenuto di umidità nel filtro impediva il passaggio delle cellule. Altrettanto critico è il posizionamento preciso dei filtri e delle gocce sulle piastre e sui filtri, entrambi influenzando il successo dell’isolamento delle cellule.

Potenziali insidie e limitazioni
Pur presentando un approccio strutturato per l’isolamento e l’identificazione delle specie di Campylobacter da campioni di pollo crudo, diverse limitazioni di questo protocollo meritano attenzione. La contaminazione esterna, le piastre non sufficientemente essiccate, l’intasamento dei filtri che impediscono il movimento microbico, l’intrappolamento dei microrganismi all’interno del pellet, la chiusura incompleta della camera atmosferica e le gocce che si diffondono oltre i confini del filtro sono tra le principali insidie.

Una separazione inadeguata dei microrganismi dalle superfici degli alimenti o il loro confinamento all’interno della maggior parte del campione può ostacolare il loro isolamento con questo metodo. Inoltre, affidarsi alla motilità microbica per l’attraversamento attraverso i filtri passivi presenta una notevole limitazione; è possibile che le membrane filtranti abbiano trattenuto alcuni ceppi di Campylobacter meno mobili, poiché è stato dimostrato che i filtri possono ridurre l’efficienza di cattura dei patogeni microbici negli alimenti³⁸. Ulteriori limitazioni comprendono la natura batch dei processi di centrifugazione e filtrazione, la suscettibilità all’intasamento del filtro e l’inefficienza nella dispersione del pellet formato, che influirà sull’accuratezza delle cariche microbiche. Queste limitazioni sottolineano collettivamente la necessità di cautela e metodologie supplementari per garantire un’analisi completa, soprattutto quando si ha a che fare con vari tipi di campioni o si cercano capacità ad alto rendimento.

Suggerimenti per la risoluzione dei problemi
Per prevenire potenziali problemi, assicurati inizialmente che tutti i materiali rispettino gli standard di qualità necessari e non siano scaduti. Risolvere i problemi relativi ai filtri intasati utilizzando potenzialmente una filtrazione aggiuntiva per rimuovere eventuali contaminanti di grandi dimensioni che potrebbero limitare il passaggio del Campylobacter attraverso la membrana di nitrocellulosa. Se si osserva una contaminazione, verificare che le gocce non siano state posizionate troppo vicino al bordo del filtro e che il liquido non abbia raggiunto l’agar girando intorno al filtro anziché attraverso i pori. Se la crescita è insufficiente dopo l’arricchimento, verificare che le guarnizioni dei contenitori atmosferici siano ermetiche e non perdano.

Potenziale perfezionamento ed espansione
L’esplorazione di materiali filtranti alternativi può migliorare l’attraversamento microbico e consentire l’espansione di questo protocollo per l’uso nell’isolamento di altri microrganismi mobili da miscele eterogenee come gli alimenti. È consigliabile identificare i controlli per mantenere le varianti di Campylobacter meno mobili senza influire negativamente sulla specificità. Inoltre, mentre il test qPCR multiplexato utilizzato in questo studio ha dimostrato di avere la capacità di rilevare C.lari¹⁸ altre specie di interesse di Campylobacter possono essere incluse in questo test.

In sintesi, attraverso la valutazione di diversi parametri e impostazioni, sono state stabilite le condizioni appropriate per l’isolamento basato su filtri e l’identificazione a livello di specie di C. jejuni e C. coli dagli alimenti. Il metodo ha dimostrato di essere sensibile, specifico, robusto ed economico. Applicandolo a campioni di cibo reale, il protocollo è stato in grado di isolare 36 ceppi di C. jejuni e 13 ceppi di C. coli da 79 confezioni di carne.

Il protocollo è in linea con la direttiva FSIS 10.250.1¹⁷, che delinea la procedura per il campionamento di parti di pollo crudo, e con la direttiva MLG 41.07⁶ per l’isolamento e l’identificazione di Campylobacter. I dati suggeriscono che concentrando il campione di 4 volte e arricchendolo per 24 ore, insieme alla filtrazione e alla placcatura, si ottengono colonie isolate e confermate entro 48 ore invece di 96 ore. Il protocollo è compatibile con i metodi basati sul DNA, come il sequenziamento del genoma, per fornire una caratterizzazione completa dei ceppi di Campylobacter , compresi i loro profili di resistenza antimicrobica, le previsioni di virulenza e le relazioni filogenetiche. Il protocollo rappresenta un’alternativa promettente per il recupero e l’isolamento efficiente di Campylobacter spp. dal pollame crudo, che può facilitare gli studi epidemiologici e gli interventi di sanità pubblica.

Materials

Agar – Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin	Oxoid Ltd.	SR0183E
Atmosphere Control Gas Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2)	Becton, Dickinson and Company (BD)	260680
Atmosphere Control Vessel,  GasPak EZ CampyPak container system	Becton, Dickinson and Company (BD)	260678
Autoclave – Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Bolton broth	Oxoid Ltd.	CM0983
Brucella broth (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	211088
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
Chicken thighs, wings, drumsticks, livers	Local retailers
DNA Extraction – PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3')	Integrated DNA Technologies
Filter – 0.45 µm sterile cellulose acetate filter	Merck-Millipore LTD	DAWP04700
Filter – 0.65 µm sterile cellulose acetate filter	Merck-Millipore LTD	HAWG04700
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ')	Integrated DNA Technologies
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3')	Integrated DNA Technologies
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3')	Integrated DNA Technologies
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3')	Integrated DNA Technologies
Incubator – Inova 4230 refrigerated incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop – Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3')	Integrated DNA Technologies
Laked horse blood	Remel Inc.	R54072
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer – Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.		Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR – 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)		Equipment
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3')	Integrated DNA Technologies
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3')	Integrated DNA Technologies
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3')	Integrated DNA Technologies
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader – Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3')	Integrated DNA Technologies
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems		Equipment
Water Filtration – Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment