Summary
Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.
Abstract
La thérapie génique est une technologie puissante pour fournir de nouveaux gènes à un patient pour le traitement d’une maladie, qu’il s’agisse d’introduire un gène fonctionnel, d’inactiver un gène toxique ou de fournir un gène dont le produit peut moduler la biologie de la maladie. La méthode d’administration du vecteur thérapeutique peut prendre de nombreuses formes, allant de la perfusion intraveineuse pour une administration systémique à l’injection directe dans le tissu cible. Pour les troubles neurodégénératifs, il est souvent souhaitable d’incliner la transduction vers le cerveau et/ou la moelle épinière. L’approche la moins invasive pour cibler l’ensemble du système nerveux central consiste à injecter dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), ce qui permet au traitement d’atteindre une grande partie du système nerveux central. L’approche la plus sûre pour administrer un vecteur dans le LCR est l’injection intrathécale lombaire, où une aiguille est introduite dans la citerne lombaire de la moelle épinière. Cette technique, également connue sous le nom de ponction lombaire, a été largement utilisée chez les rongeurs néonatals et adultes et dans les modèles de grands animaux. Bien que la technique soit similaire entre les espèces et les stades de développement, des différences subtiles de taille, de structure et d’élasticité des tissus entourant l’espace intrathécal nécessitent des adaptations dans l’approche. Cet article décrit une méthode permettant d’effectuer une ponction lombaire chez des rats juvéniles afin d’administrer un vecteur de sérotype 9 adéno-associé. Ici, 25 à 35 μL de vecteur ont été injectés dans la citerne lombaire, et un rapporteur de protéine fluorescente verte (GFP) a été utilisé pour évaluer le profil de transduction résultant de chaque injection. Les avantages et les défis de cette approche sont discutés.
Introduction
La promesse des thérapies géniques à médiation virale s’est finalement concrétisée ces dernières années avec l’approbation par la FDA de traitements pour l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne, l’hémophilie par facteur IX, le cancer, etc. D’innombrables autres traitements sont actuellement en cours de développement. La thérapie génique vise à délivrer un gène thérapeutique aux cellules d’un patient. Les produits de ce nouveau gène peuvent remplacer l’activité manquante d’un gène endogène déficient, inhiber un gène toxique, tuer les cellules cancéreuses ou fournir une autre fonction bénéfique.
Pour les maladies affectant le système nerveux central (SNC), il est souvent souhaitable d’administrer le vecteur de thérapie génique directement au tissu cible. Les approches non systémiques offrent deux avantages : elles minimisent les effets secondaires hors cible qui peuvent être causés par la transduction périphérique, et elles réduisent considérablement la quantité de vecteur nécessaire pour atteindre des niveaux adéquats de transduction dans le tissu cible5.
Il existe une variété d’approches pour administrer des vecteurs de thérapie génique au SNC. L’injection intraparenchymateuse, c’est-à-dire l’injection d’un vecteur directement dans la moelle épinière ou le tissu cérébral, peut être utilisée pour l’administration dans une région définie. Cependant, pour de nombreuses maladies, une large transduction du SNC est souhaitée. Cela peut être accompli en délivrant un vecteur dans le liquide céphalo-rachidien (LCR)5, le liquide qui circule dans et autour du cerveau et de la moelle épinière. Il existe trois façons principales d’acheminer des vecteurs vers la PPC. L’approche la plus invasive est l’administration intra-ventriculaire, qui consiste à percer un trou de bavure à travers le crâne et à faire avancer une aiguille à travers le cerveau dans les ventricules latéraux. Cela produit une transduction dans tout le cerveau. Cependant, la procédure peut provoquer une hémorragie intracrânienne, et l’approche ne produit généralement qu’une transduction limitée de la moelle épinière6. L’injection dans la citerne magna à la base du crâne est moins invasive, mais comporte un risque de lésions du tronc cérébral. Bien qu’elle soit souvent utilisée dans la recherche animale5, l’injection dans la citerne magna n’est plus utilisée systématiquement en clinique7. La ponction lombaire est l’approche la moins invasive pour accéder au LCR. Il s’agit de placer une aiguille entre deux vertèbres lombaires et dans la citerne lombaire.
La ponction lombaire pour l’administration de vecteurs est couramment pratiquée chez les rats et les souris adultes et chez les souris néonatales 8,9. Les auteurs de cette étude ont récemment effectué des ponctions lombaires chez des rats juvéniles (âgés de 28 à 30 jours) pour administrer des vecteurs du virus adéno-associé de sérotype 9 (AAV9). Chez des rats adultes, une aiguille de ponction lombaire néonatale a été placée verticalement entre les vertèbres L3 et L49. Un bon placement entraîne un mouvement de la queue et un écoulement du LCR dans le réservoir de l’aiguille. Chez les rats juvéniles, cependant, aucune de ces lectures n’a pu être réalisée. Les auteurs ont ensuite tenté d’adapter une procédure sur une souris adulte à l’aide d’une seringue à insuline de 27 G insérée à un angle compris entre L5 et L610. Chez les souris adultes, qui sont généralement plus petites que les rats P28, cela ne produit pas de battement de queue, mais un mauvais placement de l’aiguille est évident par le reflux de l’injecté. Chez les rats juvéniles, cependant, cette approche a uniformément conduit à l’administration de l’injectat par voie épidurale, probablement en raison de l’élasticité différente entre les souris adultes et les rats juvéniles des couches tissulaires entourant la moelle épinière. Les approches par cathéter ont ensuite été évaluées. Plus précisément, un cathéter a été introduit par une incision dans la dure-mère de la citerne lombaire et jusqu’à la moelle épinière mi-thoracique ; Cependant, cette approche a entraîné un reflux important de l’injectat hors du site d’incision pendant l’accouchement. Les tentatives de placer le cathéter dans l’espace intrathécal par voie percutanée à l’aide d’une aiguille guide ont également été infructueuses. En raison de l’étroitesse de la largeur interlaminaire, le cathéter heurterait probablement la lame rostrale et ne progresserait pas.
Ici, une méthode est décrite pour obtenir une administration réussie et reproductible de la solution par ponction lombaire chez le rat juvénile. Cette approche peut être utilisée pour les vecteurs viraux, et probablement aussi pour les cellules, les produits pharmaceutiques et d’autres traitements.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Emory (IACUC). Des rats Sprague-Dawley (âgés de 28 à 30 jours, masse d’environ 90 à 135 g, mâles et femelles) ont été utilisés dans la présente étude.
1. Préparation du vecteur
- Décongeler le vecteur AAV9 (voir le tableau des matériaux) sur de la glace au début de l’intervention.
- Centrifugez brièvement le tube de microcentrifugation contenant le vecteur dans une centrifugeuse de table pour vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube.
- Agitez doucement le tube de microcentrifugation pour vous assurer que la solution est bien mélangée.
2. Préparation de la cage de récupération
- Placez une cage propre sur une couverture électrique (voir le tableau des matériaux) de sorte que seule la moitié de la cage soit en contact avec la couverture.
- Réglez la température de la couverture à ~37 °C.
3. Préparation de la plate-forme chirurgicale
- Réchauffez un tampon isotherme (voir le tableau des matières) à 39 °C au micro-ondes ou au bain-marie afin que le contenu devienne liquide.
- Placez le tampon isotherme sur la plate-forme chirurgicale et couvrez-le d’un tampon de paillasse absorbant et propre.
4. Préparation des animaux
- Anesthésier les rats avec de l’isoflurane dans une boîte transparente (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Commencer l’induction de l’anesthésie à l’aide de 5 % d’isoflurane et diminuer de 1 % par minute jusqu’à atteindre 2 %. Maintenez l’animal à 2 % pendant 3 min supplémentaires.
- Déplacez la boîte qui maintient l’animal dans une hotte et ouvrez la boîte.
REMARQUE : Cela limite l’exposition du chirurgien à l’anesthésique. - Retirez les poils du dos de l’animal à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique.
REMARQUE : Alternativement, une crème dépilatoire ou un rasoir manuel et de la crème à raser peuvent être utilisés. - Placez l’animal sur la plate-forme chirurgicale avec son museau dans le cône nasal d’anesthésie.
REMARQUE : L’animal peut commencer à reprendre conscience pendant que la fourrure est retirée du site chirurgical. Si cela se produit, anesthésez-le à nouveau comme décrit ci-dessus. - Appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur chaque œil pour éviter le dessèchement des cornées pendant la procédure.
- Désinfectez la zone chirurgicale à l’aide de trois applications alternées de lingettes de povidone iodée et d’isopropanol.
- Injecter le(s) antalgique(s) sous-cutané(s).
REMARQUE : La buprénorphine est généralement utilisée à une dose de 0,01 à 0,05 mg/kg, administrée toutes les 12 heures. Alternativement, une forme à libération lente de ce médicament peut être administrée une fois à 1 mg/kg pour fournir un contrôle adéquat de la douleur pendant 72 heures. Consultez l’IACUC de l’établissement pour connaître ses directives concernant la gestion de la douleur. - Injecter 100 μL de lidocaïne à 1 % par voie sous-cutanée au-dessus des apophyses épineuses L2 à L6 pour fournir une anesthésie locale.
- Placez un rouleau d’essuie-tout ou un tube de 1,5 cm de diamètre sous l’animal, juste rostral jusqu’aux hanches. Cela aide à fléchir la colonne vertébrale, ce qui facilite l’insertion de l’aiguille entre les deux lames.
- Placez un rideau fenêtré (voir le tableau des matériaux) sur l’animal, en centrant la fenestration sur la colonne lombaire.
5. Exposer la colonne lombaire
- Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant chacune des pattes de l’animal et en recherchant l’absence de réponse de retrait.
- À l’aide d’une lame de scalpel #11, créez une incision d’environ 3 cm de long dans la peau le long de la ligne médiane de L2 à L6.
- Détachez la peau du muscle en insérant une paire de ciseaux chirurgicaux incurvés stériles entre le muscle et la peau, puis en ouvrant les pointes.
- Retirez le fascia recouvrant les apophyses épineuses L2-L5.
6. Chargement de la seringue
- Pipeter 25-35 μL du vecteur (pour obtenir la dose souhaitée) dans le capuchon d’un tube de microcentrifugation stérile.
- Aspirez tout le volume dans la seringue à insuline.
REMARQUE : Veillez à ne pas aspirer d’air pendant ce processus.
7. Réalisation de l’injection
- Identifier les apophyses épineuses L5 et L4.
REMARQUE : L6 se trouve directement entre les deux crêtes iliaques, et son apophyse épineuse devrait être facile à identifier en sondant avec un instrument contondant. L’instrument peut ensuite être doucement passé à l’arrière pour trouver les limites des processus L5 et L4. - Placez une main de manière à ce que le pouce repose doucement sur la queue et une patte de l’animal. Utilisez un doigt pour stabiliser la seringue.
- Positionnez l’aiguille de la seringue de manière à ce qu’elle soit à gauche de l’apophyse épineuse L5 et alignée avec son extrémité caudale. Positionnez la seringue de manière à ce qu’elle soit à environ 30° de la ligne médiane et à 30° vers le haut du plan de la table.
REMARQUE : Il peut être utile d’utiliser un microscope chirurgical pour mieux identifier les points de repère et positionner la pointe de l’aiguille. - Avancez l’aiguille de la seringue vers l’avant d’environ 8 mm, au-dessus de la lame L5, puis sous la lame L4 dans la citerne lombaire jusqu’à ce que l’os soit touché. Un placement correct entraînera une contraction de la patte et/ou de la queue qui peut être vue ou ressentie par le pouce reposant sur la patte/la queue. S’il n’y a pas de contraction, retirez l’aiguille et essayez la procédure par le côté gauche. S’il n’y a toujours pas de contraction, répétez la procédure entre L4/L3 et L3/L2 si nécessaire.
- Appuyez lentement sur le piston pendant environ 5 s.
REMARQUE : Il peut y avoir une contraction dans la jambe ou la queue pendant l’injection. - Maintenez la seringue en place pendant environ 30 secondes après avoir enfoncé complètement le piston pour permettre à la pression de s’équilibrer et minimiser le reflux de l’injectat lorsque l’aiguille est retirée.
- Retirez lentement l’aiguille.
8. Fermeture de l’incision
- Approximez les bords de l’incision.
- En commençant par une extrémité de la plaie, utilisez une suture 4-0 (voir le tableau des matériaux) ou des agrafes chirurgicales pour fermer l’incision.
9. Récupération et surveillance
- Placez l’animal dans la cage préchauffée.
- Vérifiez l’animal au moins toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire.
REMARQUE : Cela devrait prendre entre 15 min et 45 min. - Pendant les trois prochains jours, effectuez des contrôles de bien-être au moins une fois par jour. Fournir des analgésiques pendant les 2 premiers jours suivant la chirurgie ou selon les exigences de l’IACUC.
- Une semaine après la chirurgie, retirez les sutures ou les agrafes.
10. Procédure de suivi
REMARQUE : Pour déterminer l’exactitude de la technique d’injection, injectez le colorant bleu trypan tel que décrit ci-dessus, puis euthanasiez immédiatement l’animal (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement) et effectuez une laminectomie pour visualiser le résultat.
- Pendant que l’animal reste sous anesthésie, euthanasiez-le en lui administrant une dose létale de pentobarbital par injection intrapéritonéale à une dose de 150 mg/kg.
- Une fois que la respiration et l’activité cardiaque cessent, ouvrez la cavité thoracique pour assurer la mort. Prolongez l’incision chirurgicale vers le dos jusqu’au cou.
- Faites une incision de 4 cm de long dans le muscle parallèlement à la colonne vertébrale des deux côtés des apophyses épineuses, en restant aussi proche que possible des apophyses.
- À l’aide d’une pince fine ou de ciseaux, retirez le muscle entre les apophyses épineuses.
- Retirez les apophyses épineuses de la L6 jusqu’à la partie inférieure de la colonne thoracique à l’aide d’un rongeur (voir tableau des matériaux). Évitez les mouvements de torsion, car cela pourrait endommager les rongeurs.
- Insérez l’extrémité inférieure du rongeur sous la lame L5 et retirez l’os recouvrant la moelle épinière en prélevant plusieurs « morsures » de celle-ci.
REMARQUE : En tirant sur l’apophyse épineuse L6, il peut être plus facile d’insérer l’extrémité du rongeur. Des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager la moelle épinière. - Continuez à élargir la laminectomie d’au moins quatre lames rostrallyes. Inspectez la surface intérieure des lames pour détecter des signes de colorant, ce qui peut indiquer un échec de l’injection.
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Representative Results
Pour déterminer la précision de la technique d’injection, un colorant, le bleu de trypan, a été utilisé comme substitut du traitement. Ce colorant se lie facilement aux protéines, de sorte qu’il reste généralement dans la structure dans laquelle il a été injecté. Cela signifie que le colorant peut ne pas prédire avec précision la distribution post-injection du produit thérapeutique ; Il est simplement utilisé pour révéler la précision de l’injection. Lorsqu’il est introduit avec succès dans la citerne lombaire, le bleu de trypan se lie à la dure-mère, colorant le périmètre de la moelle épinière en bleu. Cependant, lorsque l’aiguille ne parvient pas à pénétrer la dure-mère, le colorant se retrouve dans l’espace épidural. La dure-mère et les tissus environnants (la surface de l’os et les ligaments et muscles reliant les lames) seront colorés en bleu. Ces motifs sont facilement visibles à l’œil nu.
Il est difficile d’évaluer la différence entre une injection correctement administrée et une injection incorrecte si l’on fait simplement une coupe transversale à travers la moelle épinière et la colonne vertébrale. Au lieu de cela, il est recommandé d’effectuer une laminectomie à l’aide d’une paire de rongeurs commençant par la lame L5 et se déplaçant rostralement. Il faut veiller à ne pas endommager la dure-mère dans le processus. L’utilisation du microscope de dissection facilite ce processus. La figure 1 présente des exemples comparatifs d’injections réussies et d’injections partiellement réussies. Avec une injection réussie, peu ou pas de reflux le long de la piste de l’aiguille est observé lorsque l’aiguille est retirée. Après une injection réussie, l’ablation de la lame pour exposer la moelle épinière révèle du bleu de trypan dans la moelle épinière, mais pas à la surface de l’os (Figure 1A). Le colorant est également visible sur le tronc cérébral et le cervelet après une injection réussie (Figure 1B). En revanche, une injection partiellement réussie est mise en évidence par un reflux important de colorant dans le tractus de l’aiguille pendant le processus d’injection et/ou des signes visibles de colorant sur l’os (figure 1C).
À l’aide de la procédure ci-dessus, 28 μL d’un vecteur AAV9 exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) améliorée ont été injectés à une concentration de 3 x 1013 génomes de vecteurs/mL, pour une dose totale de 8,4 x 1011 génomes de vecteurs/animal. Quatre semaines plus tard, les animaux ont été euthanasiés et perfusés avec 4% de paraformaldéhyde10. Le cerveau et la moelle épinière ont ensuite été prélevés et préparés pour la section congelée. Des sections de 40 μm d’épaisseur ont été obtenues et colorées pour la GFP. La figure 2 donne des exemples du modèle de transduction obtenu avec ce vecteur. La transduction était généralement la plus élevée dans la moelle épinière, en particulier dans la région lombaire (figure 2A-C), probablement en raison de sa proximité avec le site d’injection. La transduction du cerveau a été réalisée (Figure 2D-F), mais, comme prévu, elle avait tendance à être plus limitée que ce qui a été observé dans la moelle épinière.
Pour illustrer la reproductibilité des résultats obtenus par un seul chirurgien expérimenté utilisant un seul lot de virus, des sections colorées du cervelet et du cortex de chacun des 15 rats injectés pour cette étude sont présentées dans les figures 3 et 4, respectivement. Les sections colorées de la moelle épinière cervicale sont également présentées pour 7 de ces 15 rats (Figure 5). Bien sûr, la quantité de transduction cérébrale peut montrer une variabilité encore plus grande avec différentes doses, lots de vecteurs et chirurgiens10.
Figure 1 : Exposition de la moelle épinière suite à une injection du colorant. Des laminectomies ont été réalisées suite à l’injection de bleu de trypan. (A) La moelle épinière est colorée en bleu lors d’une injection correctement administrée, et aucun colorant n’est visible sur l’os retiré lors de la laminectomie (flèches). (B) Le colorant peut également être observé autour du tronc cérébral. (C) Dans une injection où il y a eu un reflux important pendant l’injection, il y a moins de colorant dans le cordon et le colorant est présent à la surface de l’os (flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples de modèles de transduction obtenus après l’administration intrathécale d’AAV9-GFP. Des sections de 40 μm d’épaisseur de la moelle épinière cervicale (A), thoracique (B) et (C) lombaire ont été colorées immunohistochimiquement pour la GFP (coloration noire). Des niveaux élevés de transduction de la matière grise ont été observés à tous les niveaux. (D) En revanche, le cerveau présente une transduction globale plus clairsemée. Les cases gauche et droite sont agrandies en (E) et (F), respectivement. (E) La majorité de la coloration est observée dans le cervelet, principalement dans les neurones de Purkinje (flèches). (F) Les neurones (flèches) et les astrocytes (pointes de flèches) sont transduits dans le cortex cérébral. Barres d’échelle : (A-C) 325 μm ; (D) 5 mm ; et (E,F) 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Reproductibilité de la transduction dans le cervelet. Reproductibilité de la transduction dans le cervelet de 15 rats injectés par le même chirurgien en utilisant la même dose et le même lot du virus. Barre d’échelle : 1 mm. Les numéros sur les images indiquent les numéros d’identification des rats (« litière ». individu »). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Reproductibilité de la transduction dans le cortex. Reproductibilité de la transduction dans le cortex de 15 rats injectés par le même chirurgien avec la même dose et le même lot de virus. Barre d’échelle : 500 μm. Les numéros sur les images indiquent les numéros d’identification des rats (« litière ». individu »). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Reproductibilité de la transduction dans la moelle épinière cervicale. Reproductibilité de la transduction dans la moelle épinière cervicale de 7 rats injectés par le même chirurgien en utilisant la même dose et le même lot de virus. Barre d’échelle : 500 μm. Les numéros sur les images indiquent les numéros d’identification des rats (« litière ». individu »). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une grande variété de maladies affectent le SNC. Fournir une copie fonctionnelle du gène pertinent via un vecteur viral est une stratégie de traitement attrayante pour ceux qui sont récessifs et monogéniques par nature, comme l’amyotrophie spinale. Cependant, la barrière hémato-encéphalique (BHE) exclut la plupart des vecteurs de thérapie génique administrés par voie intraveineuse11. Ceux qui peuvent traverser la BHE, comme l’AAV9, doivent être administrés à fortes doses pour surmonter la perte de vecteur due à la transduction périphérique12. L’âge est également un obstacle. L’exposition environnementale aux différents sérotypes AAV augmente avec l’âge de13 ans et conduit souvent à la production d’anticorps capables de neutraliser les vecteurs thérapeutiques14. Par conséquent, l’administration intraveineuse de vecteurs de thérapie génique pour les troubles du SNC est généralement limitée aux nourrissons et n’est pas utilisée chez les patients diagnostiqués plus tard dans la vie.
Pour les patients plus âgés, l’injection directe de vecteur dans le LCR peut produire une large transduction dans le SNC, contournant à la fois la BHE et les anticorps anti-AAV préexistants15. Comme cette approche est ciblée, des doses de vecteurs plus faibles peuvent également être utilisées. Il existe deux approches principales en milieu clinique : (1) la ponction lombaire et (2) l’injection dans les ventricules latéraux. Ce dernier comporte plus de risques, mais fournit généralement une plus grande transduction cérébrale. La ponction lombaire est plus sûre, mais la transduction est biaisée vers la moelle épinière. La transduction cérébrale pourrait être améliorée en plaçant le patient en position de Trendelenburg, mais les données à ce sujet sont mitigées16,17. L’utilisation d’un cathéter pour atteindre la citerne magna via une ponction lombaire peut offrir une meilleure option en clinique, mais elle en est à un stade précoce d’utilisation5. Il peut y avoir d’autres défis à relever pour transposer à la clinique les approches élaborées dans les modèles animaux, tels que la perte de vecteurs due à la fuite de LCR18 et la toxicité dans les ganglions de la racine dorsale19.
La plupart des études sur les thérapies dirigées vers le SNC effectuées chez les rongeurs utilisent des nouveau-nés ou des animaux adultes (âgés de >60 jours). Les nouveau-nés ont l’avantage d’une petite taille, ce qui permet d’obtenir des doses efficaces plus élevées, et d’un système immunitaire immature, évitant les complications d’une réponse immunitaire contre le médicament. Cependant, en termes de développement cérébral, une souris ou un rat nouveau-né représente mieux un stade fœtal chez l’homme. Pour les thérapies destinées aux enfants âgés de 5 à 10 ans, le rat juvénile (25-35 jours) est un meilleur modèle en termes de développement neurologique20. Étant donné qu’aucune méthode d’injection intrathécale n’avait été décrite auparavant chez les rats juvéniles et que les méthodes établies pour les souris et les rats adultes se sont révélées inefficaces chez les rats de cet âge, l’approche décrite ci-dessus a été mise au point. Pour être clair, les rats juvéniles sont non seulement plus petits que les adultes, mais peuvent également différer dans l’élasticité de la dure-mère qui protège la moelle épinière, ce qui rend inefficace une procédure qui fonctionne pour percer cette couche chez un rat adulte chez un jeune.
Lors de l’apprentissage de l’injection intrathécale chez des rats juvéniles, l’utilisation d’un colorant (tel que le bleu de trypan) comme substitut du traitement est nécessaire, et l’utilisateur doit être très confiant dans sa capacité à effectuer la procédure avec succès et de manière reproductible avant de commencer une étude avec un médicament. Pour maîtriser la technique, il faudra s’entraîner pour acquérir de l’expérience sur la sensation de la seringue lorsque la trajectoire est conforme à la cible ou hors cible. Il y a deux erreurs courantes. Si l’angle d’approche est trop peu profond, l’aiguille va frapper le haut de l’une des lames ou l’arrière de la lame rostrale. Il n’y aura pas de contraction et la distance parcourue par l’aiguille sera de quelques millimètres en dessous de 8 mm. Si l’angle d’approche est trop important, il y a un risque que l’aiguille passe entre les deux lames et pénètre dans la cavité abdominale. Lorsque cela se produit, l’aiguille avancera beaucoup plus loin que 8 mm. Si cela se produit, retirez l’aiguille, repositionnez-la et réessayez. Dans les rares occasions où cela s’est produit, l’entrée transitoire dans la cavité abdominale de quelques millimètres avant le retrait et le repositionnement n’a pas causé de dommages durables apparents aux animaux.
Il a été constaté que l’observation d’une réponse physique à la mise en place de l’aiguille est essentielle pour obtenir une reproductibilité avec un taux de réussite élevé avec cette procédure. Lorsqu’il n’y a pas eu de réponse, le taux de réussite de l’injection était faible. Cependant, dans certains cas, un animal a dû être tenté à plusieurs endroits pour obtenir une réponse, et des traces de colorant ont été observées dans une ou plusieurs des traces d’aiguille précédentes. Aucun colorant n’a été observé dans l’espace épidural, ce qui suggère que certaines des piqûres d’aiguille précédentes avaient pénétré la dure-mère sans produire de contraction de la queue ou de la patte. Étant donné que le reflux était minime (semblable à ce qui est observé dans la trace de l’aiguille lors de l’injection), on pense que l’effet des piqûres d’aiguille précédentes sur l’efficacité de l’administration dans ces cas était négligeable.
Une fois que l’on atteint la maîtrise de la technique d’accouchement, un deuxième défi non chirurgical peut être rencontré. Plus précisément, chez les rats adultes (âgés de ~70 jours), la puissance des vecteurs AAV9 pour l’administration intrathécale à la moelle épinière et au cerveau peut varier considérablement d’un lot à l’autre, même lorsqu’ils sont générés par le même noyau de vecteur. Certains lots fonctionneront comme prévu, produisant une transduction dans la matière grise de la moelle épinière sur toute sa longueur. D’autres, cependant, ne parviendront pas à pénétrer la matière grise, transduisant principalement les ganglions de la racine dorsale10. La cause de cette variabilité n’est pas claire, car les vecteurs sont puissants in vitro et lorsqu’ils sont injectés directement dans la moelle épinière. Il est recommandé d’effectuer une étude pilote portant sur 3 ou 4 animaux avec tout nouveau lot de virus afin de confirmer que le nouveau lot fonctionne comme prévu avant de commencer une étude à grande échelle. L’activité peut être évaluée à l’aide d’une coloration immunohistochimique ou d’immunofluorescence du produit du transgène protéique ou de la quantification de la quantité d’ARNm de transgène ou de génomes de vecteurs à l’aide de la PCR quantitative ou de la ddPCR21. En plus des variables inconnues qui distinguent les lots viraux, de petites différences dans l’âge de l’animal, le volume d’injection, la vitesse d’administration et la concentration du vecteur peuvent entraîner une variabilité des résultats. Avant de commencer une étude à grande échelle, il peut être nécessaire de les optimiser pour chaque virus ou autre agent thérapeutique candidat.
Une fois formé, un chirurgien expérimenté peut terminer la procédure d’injection intrathécale d’un rat juvénile dans un délai d’environ 30 minutes, de l’induction de l’anesthésie au début de la période de récupération. Cela permet de traiter de grandes cohortes en peu de temps. La récupération de l’opération est également rapide. La plupart des animaux se déplacent normalement en 20 à 30 minutes. Après avoir effectué plus de 200 de ces chirurgies, aucun effet indésirable de cette procédure n’a été observé.
Enfin, la minimisation de la détresse des animaux et la garantie de leur bien-être pendant les interventions chirurgicales sont des considérations primordiales. Ainsi, l’utilisation appropriée d’anesthésiques et d’analgésiques est requise, et la température corporelle doit être maintenue pendant la procédure et jusqu’à ce que l’animal se remette complètement de l’anesthésie. Les organismes de réglementation compétents et le personnel vétérinaire de différentes institutions peuvent avoir des exigences et des recommandations différentes concernant ces sujets. L’utilisation des anesthésiques et des analgésiques décrits dans cette procédure a été développée en consultation avec les vétérinaires de l’Université Emory et le personnel de l’IACUC. Les chercheurs doivent travailler en étroite collaboration avec leurs vétérinaires locaux et l’IACUC pour atteindre les objectifs nécessaires.
Cette procédure présente certaines limites. La méthode décrite ici a été mise au point pour être utilisée chez les rats juvéniles, et une myriade de différences structurelles et autres entre les humains et les rats peuvent limiter l’application de ces procédures aux humains. L’intérêt de permettre l’injection intrathécale lombaire d’un traitement thérapeutique chez les rats juvéniles est de faciliter l’utilisation du modèle de rat juvénile pour tester l’efficacité du traitement thérapeutique candidat - même si le mode d’administration précis devrait être modifié pour être appliqué chez les patients.
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Disclosures
Le Dr Donsante est l’inventeur d’un brevet en instance concernant l’administration de vecteurs AAV9 dans le LCR.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi et Lacey Stearman de UT Southwestern pour une discussion productive sur le défi posé par les rats juvéniles pour l’injection intrathécale. Ce travail a été en partie soutenu par un financement de Jaguar Gene Therapy (à JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
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