Summary
यह लेख वयस्क ज़ेनोपस में छह महत्वपूर्ण और विविध अंगों के नमूने के लिए एक गाइड प्रस्तुत करता है जिसे तेजी से और आसानी से एक्सेस किया जा सकता है: हृदय वेंट्रिकल, यकृत लोब, अग्न्याशय, वसा शरीर, युग्मित गुर्दे और त्वचा।
Abstract
ज़ेनोपस सौ से अधिक वर्षों से कशेरुक विकास और बीमारी को समझने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव रहा है। जबकि भ्रूण के प्रयोगात्मक विश्लेषण और विच्छेदन तकनीकों को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, वयस्क ज़ेनोपस संरचनाओं और अंगों के विवरण, वयस्कों के साथ काम करने की तकनीकों के साथ, मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स और एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स जैसे आधुनिक दृष्टिकोणों की आवश्यकताओं को ध्यान में रखने के लिए अद्यतन नहीं किया गया है। सेल-प्रकार और जीन-केंद्रित दृष्टिकोणों को वयस्क ऊतकों में उन लोगों के लिए भ्रूण के चरणों में विपरीत टिप्पणियों की आवश्यकता होती है। लार्वा के अंग अपनी समग्र संरचना, आकृति विज्ञान और शारीरिक स्थान में लार्वा के साथ वयस्क संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन से गुजरते हैं, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर कायापलट रीमॉडेलिंग के दौरान। अंग पहचान और विच्छेदन के लिए मजबूत मानकों की स्थापना विभिन्न प्रयोगशालाओं में किए गए अध्ययनों से उत्पन्न डेटासेट सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेनोपस में अंगों में से छह की पहचान करता है, हृदय वेंट्रिकल, यकृत, वसा शरीर, अग्न्याशय, युग्मित गुर्दे, और वयस्क ज़ेनोपस की त्वचा के विच्छेदन और नमूने के लिए तरीकों का प्रदर्शन करता है। संरक्षण विधियों के आधार पर, विच्छेदित अंगों का उपयोग मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स, एकल कोशिका / नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, स्वस्थानी संकरण, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, ऊतक विज्ञान, आदि के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल ऊतक नमूना मानकीकृत और वयस्क अंग प्रणालियों की बहु प्रयोगशाला जांच की सुविधा के लिए करना है.
Introduction
हालांकि वयस्क ज़ेनोपस "का "डिजिटल विच्छेदन"1 उपलब्ध है, वयस्क ज़ेनोपस के प्रतिकृति अंग और ऊतक नमूना अन्य वयस्क मॉडल (जैसे चूहों 2,3,4) के लिए उपलब्ध विस्तृत निर्देश के बिना चुनौतीपूर्ण रहता है। इस लेख का उद्देश्य वयस्क ज़ेनोपस के सटीक और प्रतिकृति अंग नमूने के लिए स्पष्ट मार्गदर्शन प्रदान करना है, जो वर्तमान में उनके लार्वा5 के लिए उपलब्ध है। अधिकतम ताजगी बनाए रखने और प्रोटोकॉल को सभी उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने के लिए पूरा करने में आसानी पर जोर दिया जाता है।
हालांकि राणा sp.6 के लिए एक पूरी तरह से विच्छेदन गाइड है, साथ ही अन्यअनुरानों 7 के लिए कई कक्षा विच्छेदन गाइड, कोई ज़ेनोपस विच्छेदन और नमूना गाइड वर्तमान में उपलब्ध नहीं है। उन लोगों के लिए जो नमूना प्रथाओं या उभयचर शरीर रचना विज्ञान से परिचित नहीं हैं, ज़ेनोपस और अन्य अनुरानों के बीच छोटे अंतर इन संसाधनों को प्रतिकृति ऊतक नमूनाकरण के लिए उप-इष्टतम प्रदान करते हैं।
कई मूल्यवान ऊतकों को शामिल नहीं किया गया है और यहां तक कि वर्तमान गाइड में भी त्याग दिया गया है; यह ऊतक की ताजगी सुनिश्चित करने के लिए है। छह नमूने यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सीमित हैं कि इन ऊतकों को एक घंटे के भीतर एकत्र किया जा सकता है जब दिल धड़कना शुरू कर देता है, उपयोगकर्ता के अनुभव या कौशल स्तर की परवाह किए बिना। कई अन्य ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए अधिक उन्नत और विस्तृत गाइड अलग-अलग साथी कागजात के रूप में तैयार किए जा रहे हैं।
कम अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए, यह हमेशा सिफारिश की जाती है कि इस प्रोटोकॉल को पहले जानवरों पर प्रयोग के अलावा अन्य कारणों से इच्छामृत्यु का प्रयास किया जाए, जो किसी भी जानवर को बदलने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं (यानी, ट्रांसजेनिक्स, उन्नत उम्र के जानवर, आदि)। आदर्श रूप से, नमूना लिए गए सभी जानवर स्वस्थ होंगे और, यदि मादा, पिछले दो हफ्तों में ओव्यूलेट नहीं हुई होगी।
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Protocol
सभी प्रयोगों हार्वर्ड मेडिकल स्कूल IACUC (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) (आईएस 00001365_3) के नियमों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया. प्रतिनिधि परिणाम एक perfused और unperfused परिपक्व अल्बिनो पुरुष Xenopus laevis दोनों के लिए दिखाए जाते हैं.
1. प्रायोगिक तैयारी
नोट: छिड़काव प्रोटोकॉल8 नमूना लेने से पहले पालन किया जा रहा है, तो 2.2 कदम करने के लिए छोड़ दें.
- सुनिश्चित करें कि अनुसंधान संस्थान ने इस प्रोटोकॉल में वर्णित इच्छामृत्यु तकनीक को मंजूरी दे दी है।
- 5 ग्राम/एल एमएस-222 (ट्राइकेन मेथेनसल्फोनेट) और 5 ग्राम/एल सोडियम बाइकार्बोनेट ( सामग्री की तालिकादेखें) का घोल तैयार करें। पूरी तरह से इच्छामृत्यु किए जा रहे जानवरों को कवर करने के लिए आवश्यक मात्रा से अधिक मात्रा होनी चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए पीएच की जांच करें कि यह ≥7 है।
- इच्छामृत्यु समाधान में ज़ेनोपस रखकर प्राथमिक इच्छामृत्यु करें; जानवर कुल 1 घंटे के लिए जलमग्न रहेगा।
- विच्छेदन स्टेशन सेट करें ताकि नमूना लेने के तुरंत बाद, सभी ऊतकों को ठंडा पीबीएस या 0.7x पीबीएस9 (प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर) में धोया जा सकता है, चेक किया जा सकता है, और 5x (या अधिक) आवर्धन प्रकाश के तहत छंटनी की जा सकती है। इस स्टेशन भी उपयोगकर्ता या तो सभी संदंश और कैंची को बदलने के लिए या उपयोग करता है के बीच उन्हें साफ पोंछने के लिए सक्षम करना चाहिए.
- एक बार जब मेंढक 1 घंटे के लिए समाधान में रहा है, तो प्राथमिक इच्छामृत्यु पूरी हो गई है। मेंढक को हटा दें और पैर चुटकी करके दर्द प्रतिक्रिया के नुकसान की जांच करें।
- जानवर के लिए उपयुक्त विवरण रिकॉर्ड करें, जैसे कि प्रजातियां, तनाव, लिंग, आयु और स्वास्थ्य की स्थिति के साथ-साथ यदि यह छिद्रित था। ज़ेनोपस का वजन करें और कोई भी अतिरिक्त माप लें, जैसे कि थूथन-वेंट लंबाई।
- मेंढक को उसकी पीठ पर रखें और शरीर के समीपस्थ अंगों को पिन करें (चित्र 1)।
- विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, त्वचा के माध्यम से कटौती, midline ऊपर, और फिर पार्श्व रूप से, दो फ्लैप बनाने.
- चित्रा 2 का जिक्र करते हुए, लाइनिया अल्बा की पहचान करें और इसे समझने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे कोइलोमिक गुहा से दूर खींचें। कैंची का उपयोग करके सावधानी से मांसलता के माध्यम से काटें। गुहा की दीवार से दो फ्लैप बनाएं। रास्ते से सभी फ्लैप को काटें या पिन करें।
- उस दिल की पहचान करें जो अभी भी धड़क रहा होगा। दिल के लिए बेहतर पहुँच प्राप्त करने के लिए कोरैकॉइड हड्डियों (चित्रा 2) को कम करने के लिए विदारक कैंची का प्रयोग करें.
नोट: यदि नमूना लेने से पहले दिल ने धड़कना बंद कर दिया है, तो यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूना ताजगी से समझौता किया गया है।
2. नमूनाकरण
नोट: यदि जानवर को छिद्रित किया गया है, तो चरण 2.2 पर जाएं।
- पतली पेरिकार्डियम की पहचान करें और इसे ऊतक संदंश(चित्रा 3)के साथ तना हुआ खींचें।
- इरिडेक्टोमी कैंची की नोक का उपयोग करके, धीरे से पेरीकार्डियम को छिद्रित करें, अंतर्निहित ऊतकों को काटने के लिए सावधान रहें। दिल के 3 कक्षों से दूर पेरीकार्डियम छीलें।
- शीर्ष द्वारा वेंट्रिकल को समझने के लिए संदंश का उपयोग करें, पहचानें कि यह एरिकल्स और धमनी ट्रंक (चित्रा 4) से कहां जुड़ता है, और इसे इन अनुलग्नकों (चित्रा 5)के नीचे काट लें। यदि आवश्यक हो, तो वेंट्रिकल को ट्रिम करें ताकि एरिकल्स या धमनी ट्रंक से कोई ऊतक दिखाई न दे, और हल्के रंग के वाल्व ऊतक अभी भी वेंट्रिकल के अंदर दिखाई देंगे।
नोट: unperfused जानवरों में, वेंट्रिकल को हटाने माध्यमिक इच्छामृत्यु के रूप में अर्हता प्राप्त कर सकते हैं. - जिगर के 3 पालियों (चित्रा 6 और चित्रा 7) दिखाई देगा. बाएं लोब (दर्शक के दाईं ओर) के होंठ को समझें और धीरे से इसे उठाएं ताकि यकृत और सिस्टिक नलिकाएं दिखाई दे रही हैं (चित्र 8)। इन अनुलग्नकों (चित्रा 9) के नीचे पालि के नीचे 1/3 नमूना.
- मादा मेंढक के ऊतकों तक बेहतर पहुंच प्राप्त करने के लिए, अंडाशय को हटाने में सहायक होता है। उस अंडाशय की पहचान कीजिए जो आंत के पेरिटोनियम की एक परत में ढका हुआ है जिसे जर्मिनल एपिथेलियम कहा जाता है। धीरे पालियों शिफ्ट जब तक वे अपने संबंधित पक्षों पर हैं लगाव के क्षेत्र को दृश्यमान बनाने के लिए (चित्रा 10). ये संलग्नक सीधे युग्मित गुर्दे के लिए उदर होते हैं।
- कैंची का उपयोग करके, अंडाशय को गुर्दे के करीब जितना संभव हो उतना नुकसान पहुंचाए बिना हटा दें (चित्र 11)।
- जिगर की औसत दर्जे का पालि (भी पूर्वकाल पालि कहा जाता है) का निरीक्षण करें और ध्यान दें कि यह मेसेंटरी और हेपेटोपैनक्रिएटिक वाहिनी (जिसे सामान्य पित्त नली भी कहा जाता है) (चित्रा 6, चित्रा 7, और चित्रा 8) के माध्यम से पेट और ग्रहणी से कैसे जुड़ता है।
- इरिडेक्टोमी कैंची के साथ-साथ हेपेटोपैनक्रिएटिक डक्ट का उपयोग करके मेसेंटरी, हेपेटोडोडोडेनल लिगामेंट को अलग करें जहां यह ग्रहणी से मिलता है। अग्न्याशय और हेपेटोपैनक्रिएटिक वाहिनी के कनेक्शन को यकृत के औसत दर्जे का लोब से अलग करें ताकि कोई अंधेरे यकृत ऊतक संलग्न न हो (चित्र 12)।
- दांतेदार संदंश और ऊतक संदंश के साथ अग्न्याशय के बेहतर अंत के साथ पेट समझ. 5x आवर्धन के तहत, धीरे पेट (चित्रा 13) से अग्न्याशय छेड़ना.
नोट: यदि यह सफाई से दूर नहीं आता है, तो शेष अग्नाशय के ऊतक दिखाई देंगे और टुकड़ों में उठाए जा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, अग्न्याशय को विधिपूर्वक iridectomy कैंची और ऊतक संदंश का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। - चित्रा 14 ए का जिक्र करते हुए, मूत्राशय की पहचान करें और इसे हटा दें, जितना संभव हो क्लोका के करीब काट लें। इस ऊतक को त्यागें।
- चित्रा 14 बी का जिक्र करते हुए, बड़ी आंत की पहचान करें और इसे संभव के रूप में क्लोका के करीब बड़ी आंत को अलग करने के लिए तना हुआ खींचें। पूरे एलिमेंटरी कैनाल को निकालें और त्यागें, पेरिटोनियम को अलग करें जहां यह प्लीहा से जुड़ता है। मोटे शरीर अब पूरी तरह से सुलभ होंगे।
- वसा निकायों को अलग करें ताकि वे अपने-अपने पक्षों पर हों। गुर्दे के ऊपर का क्षेत्र, जहां वसा शरीर पेरिटोनियम से जुड़ता है, दिखाई देगा। बाएं वसा शरीर (दर्शक के दाईं ओर) के आधार को समझें और इसे पेरिटोनियम से दूर काटने के लिए कैंची का उपयोग करें, जिससे एक छोटा मार्जिन छोड़ दिया जाए ताकि गुर्दे को नुकसान न पहुंचे(चित्रा 15)।
- बचे हुए मोटे शरीर को निकालें और त्यागें। युग्मित गुर्दे अब पूरी तरह से दिखाई देंगे।
- मादा मेंढकों या अलग-अलग अवशिष्ट डिंबवाहिनी वाले पुरुषों में, एक डिंबवाहिनी को पकड़ें और इसे गुर्दे और क्लोअका (चित्र 16) से दूर खींचें। डिंबवाहिनी को काटें जहां यह क्लोका से मिलता है और इसे गुर्दे से दूर खींचना जारी रखता है, किसी भी स्पष्ट पेरिटोनियल अनुलग्नकों को काटता है क्योंकि वे स्पष्ट हो जाते हैं। इस ऊतक को त्यागें।
- शेष डिंबवाहिनी के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- गुर्दे अभी भी स्पष्ट पेरिटोनियम (रेट्रोपरिटोनियल)10के साथ कवर किए गए हैं। गुर्दे को समझने और पेरिटोनियम को उनके अवर छोर पर तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- गुर्दे को कोइलोमिक गुहा से बाहर निकालें, कैंची का उपयोग करके पेरिटोनियम को गुर्दे के जितना संभव हो उतना करीब तोड़ने के लिए उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना (चित्र 17)।
- 5x आवर्धन के तहत, अतिरिक्त पेरिटोनियम और किसी भी अन्य शेष ऊतक (वसा शरीर, प्लीहा) को काट लें। यदि मेंढक मादा है, तो सुनिश्चित करें कि किसी भी शेष अंडाशय ऊतक को हटा दिया गया है (चित्र 18)। यदि मेंढक नर है, तो वृषण को ध्यान से हटा दें और एक अवशिष्ट डिंबवाहिनी की जांच करें, जो आवर्धन के बिना दिखाई नहीं दे सकता है (चित्र 19)।
- जानवर से पिन निकालें, यह अपने वेंट्रम पर फ्लिप, और जानवर के अंगों फिर से पिन.
- से नमूना करने के लिए या तो hindlimb का चयन करें और उस अंग के पैर पिन.
- गैस्ट्रोकनेमियस/टिबियोफिबुला (चित्र 20) के ऊपर से त्वचा के बादाम के आकार का फ्लैप निकालें।
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Representative Results
चित्रा 1 से चित्रा 20 का उपयोग करके और इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों का पालन करके, हृदय वेंट्रिकल, यकृत के बाएं लोब, अग्न्याशय, बाएं वसा शरीर, युग्मित गुर्दे, और त्वचा के एक प्रालंब को इच्छामृत्यु के एक घंटे के भीतर सफाई से निकाला गया था। इस समय के भीतर, नमूनों को धोया जाता है और छंटनी की जाती है ताकि वे दिखाई दें, जैसा कि चित्र 21में दिखाया गया है।
चित्र 1: पिन किया गया ज़ेनोपस। एक परिपक्व महिला X. ट्रॉपिकलिस प्रत्येक अंग के माध्यम से पिन किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: पेट की दीवार। एक एक्स ट्रॉपिकलिस मादा की उदर त्वचा को फ्लैप में काट दिया जाता है, जिससे लाइनिया अल्बा और कोरैकॉइड हड्डियां दिखाई देती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: पेरीकार्डियम संलग्न दिल। हृदय वेंट्रिकल के शीर्ष को पेरिकार्डियम के माध्यम से समझा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: हृदय वेंट्रिकल और धमनी ट्रंक। एक छिद्रित एक्स लेविस का वेंट्रिकल, पकड़ा जा रहा है, धमनी ट्रंक के प्रति अपना लगाव दिखा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: हृदय आरेख। एक धराशायी रेखा के साथ दिल की प्रासंगिक संरचनाओं का एक आरेख यह दर्शाता है कि वेंट्रिकल का नमूना कहां है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: हेपेटोपैनक्रिएटिक आरेख। यकृत, अग्न्याशय और संबंधित अंगों के 3 पालियों का आरेख। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7: हेपेटोपैनक्रिएटिक अंग। एक छिद्रित, अल्बिनो एक्स. लेविस पुरुष जिसमें यकृत, अग्न्याशय और संबंधित अंगों के 3 लोब लेबल होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: सिस्टिक और यकृत नलिकाएं। यकृत के बाएं लोब को छिद्रित एक्स में सिस्टिक और यकृत नलिकाओं को दिखाने के लिए उठाया जा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 9: जिगर नमूनाकरण। एक unperfused एक्स उष्णकटिबंधीय के बाएं जिगर लोब यकृत नलिकाओं के संलग्नक के तहत अलग कर दिया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 10: अंडाशय लगाव। अपने संबंधित पक्षों पर अंडाशय लोब के साथ, पेरिटोनियल दीवार (गुर्दे के ऊपर) के लिए जर्मिनल एपिथेलियम की निरंतरता दिखाई देती है। दो सफेद धराशायी रेखाएं इंगित करती हैं कि इन अनुलग्नकों को कहां तोड़ना है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 11: अंडाशय हटाने। एक unperfused एक्स laevis के अंडाशय, युग्मित गुर्दे से दूर खींच लिया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 12: मेसेंटरी चीरों। एक unperfused X. laevis की coelomic गुहा, हृदय वेंट्रिकल के नमूने और जिगर के बाएं लोब के साथ-साथ अंडाशय को हटाने के बाद। एक सफेद धराशायी रेखा इंगित करती है कि हेपेटोपैनक्रिएटिक लिगामेंट और डक्ट को कहां तोड़ना है, जबकि एक हरे रंग की धराशायी रेखा इंगित करती है कि यकृत के औसत दर्जे का लोब से अग्न्याशय को कहां तोड़ना है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 13: अग्न्याशय का नमूनाकरण। एक अनपेक्षित एक्स लाविस के अग्न्याशय को पेट से छेड़ा जा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 14: अंग हटाना। (ए) एक अप्रभावित एक्स लाविस के मूत्राशय को क्लोका से एक धराशायी रेखा के साथ खींचा जाता है जो दर्शाता है कि इसे कहां काटना है। (बी) एक unperfused एक्स laevis, क्लोका से दूर एक धराशायी रेखा के साथ खींचा जा रहा है जहां यह दर्शाता है कि इसे अलग करने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 15: वसा शरीर का नमूनाकरण। युग्मित गुर्दे के बेहतर छोर पर पेरिटोनियम से जुड़े वसा निकायों को कोइलोमिक गुहा से बाहर निकाला जाता है, जिसमें एक धराशायी रेखा होती है जिसमें दिखाया जाता है कि उन्हें कहां काटना है। ध्यान दें कि इस लगाव से सटे, इस पुरुष एक्स ट्रॉपिकलिस में 1 वृषण के साथ-साथ अलग-अलग अवशिष्ट डिंबवाहिनी की एक जोड़ी है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 16: डिंबवाहिनी हटाना। एक छिद्रित X. laevis के डिंबवाहिनी को युग्मित गुर्दे से दूर खींचा जाता है, जिससे स्पष्ट पेरिटोनियम दिखाई देता है। एक धराशायी रेखा इंगित करती है कि पेरिटोनियम को कहां उकसाना है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 17: किडनी का नमूनाकरण। एक अनपेक्षित एक्स लाविस के युग्मित गुर्दे को कोइलोमिक गुहा से बाहर निकाला जा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 18: किडनी ट्रिमिंग। (ए) एक unperfused महिला एक्स laevis संबद्ध पेरिटोनियल अंगों के साथ जोड़ा गुर्दे का एक उदर दृश्य. (बी) संबद्ध अंगों के साथ एक ही गुर्दे को हटा दिया गया लेकिन कुछ पेरिटोनियल ऊतक शेष के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 19: वृषण हटाना। एक वृषण के साथ unperfused X. tropicalis के युग्मित गुर्दे हटा दिए गए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 20: त्वचा का नमूना। (ए) एक एक्स का दाहिना पैर उष्णकटिबंधीयएक धराशायी रेखा के साथ त्वचा के क्षेत्र को दर्शाता है जिसका नमूना लिया जाना है। (बी) टिबियोफिबुला पर हटाए गए त्वचा के नमूने के साथ एक्स ट्रॉपिकलिस का दाहिना पैर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 21: अंग नमूनाकरण के प्रतिनिधि परिणाम। हृदय वेंट्रिकल, यकृत, अग्न्याशय, वसा शरीर, युग्मित गुर्दे, और त्वचा के नमूने एक छिद्रित और अप्रभावित अल्बिनो एक्स लेविस से लिए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल ताजगी को अधिकतम करने के लिए करना है के रूप में, कुछ नमूनों अवांछित ऊतकों शामिल हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, हेपेटोपैनक्रिएटिक डक्ट और कुछ मेसेंटरी को अग्न्याशय के साथ नमूना लिया जाता है, और कुछ पेरिटोनियल ऊतक, अधिवृक्क ग्रंथियों और मूत्रवाहिनी को हमेशा युग्मित गुर्दे के साथ नमूना लिया जाएगा। यदि ताजगी चिंता का विषय नहीं है, तो संशोधित तकनीकों का उपयोग करके अधिक सटीक नमूना प्राप्त किया जा सकता है।
अंगों की उपस्थिति और स्थान लिंगों और ज़ेनोपस की प्रजातियों के बीच तुलनीय हैं। हालांकि, ऊतकों का रंग इस आधार पर काफी भिन्न होता है कि जानवरों को छिद्रित किया गया है या नहीं। यह इस कारण से है कि दोनों perfused और unperfused जानवरों की छवियों को शामिल कर रहे हैं.
इस प्रोटोकॉल की एक बाधा यह है कि गति और प्रजनन क्षमता को नमूने एकत्र करने पर प्राथमिकता दी जाती है जो वांछित ऊतक की संपूर्णता का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करते हैं। उदाहरण के लिए, यहां नमूना लिए गए यकृत के बाएं लोब का खंड यकृत ऊतक के सभी तीन पालियों का पर्याप्त रूप से प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। यदि नमूनाकरण में त्रुटियां हैं, तो समस्या निवारण के विकल्प ऊतक के विभिन्न वर्गों के बीच भिन्नता की संभावना से प्रभावित होते हैं। उदाहरण के लिए, यह ज्ञात नहीं है कि यकृत का दाहिना लोब, सही वसा शरीर, या त्वचा का एक अलग हिस्सा वांछित ऊतकों के लिए कार्यात्मक विकल्प होगा। इन मामलों में, ऊतक के वर्गों को प्रतिस्थापित करने से पहले, अनुसंधान की जरूरतों के आधार पर विवेक का उपयोग किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यदि जानवरों का नमूना लिया जा रहा है तो कठोर शारीरिक दोष या नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण स्वास्थ्य समस्याएं हैं, कोइलोमिक गुहा में अंग यहां वर्णित के रूप में प्रकट नहीं हो सकते हैं। Granulomas माइकोबैक्टीरियम spp.11,12 से संक्रमित मेंढकों के ऊतकों में पाया गया है, और डिम्बग्रंथि hyperstimulation सिंड्रोम के पिछले मामलों अंगों13 की एक असामान्य प्रस्तुति के लिए नेतृत्व करने के लिए प्रकट होते हैं.
हालांकि इस विधि प्रयोगशाला Xenopus के लिए विकसित किया गया है, कई गैर सीसिलियन उभयचरों और अंग सरीसृप14 के भीतर इन अंगों की उपस्थिति में महत्वपूर्ण समानताएं हैं. इस प्रोटोकॉल के नमूना भाग को आसानी से अन्य मॉडलों, जैसे एक्सोलोटल या ग्रीन एनोल के लिए संशोधित किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच के ओडी अनुदान R24OD031956 द्वारा समर्थित किया गया था। हम सामंथा जलबर्ट, जिल राल्स्टन और कोरा एंडरसन को उनकी सहायता और समर्थन के साथ-साथ हमारे संपादक और अनाम सहकर्मी समीक्षकों को उनकी उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R.
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
