Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

Summary

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Abstract

La investigación preclínica de terapia génica, particularmente en modelos de roedores y animales grandes, requiere la producción de vectores AAV con alto rendimiento y pureza. Los enfoques tradicionales en los laboratorios de investigación a menudo implican el uso extensivo de placas de cultivo celular para cultivar células HEK293T, un proceso que puede ser laborioso y problemático. Aquí, se presenta un método interno único, que simplifica este proceso con una plataforma específica de fábrica de celdas (o pilas de celdas, CF10). La integración de la partición bifásica de polietilenglicol/acuoso con la ultracentrifugación en gradiente de yodixanol mejora tanto el rendimiento como la pureza de los vectores AAV generados. La pureza de los vectores AAV se verifica mediante SDS-PAGE y tinción de plata, mientras que la proporción de partículas llenas y vacías se determina mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Este enfoque ofrece una plataforma de fábrica de células eficiente para la producción de vectores AAV con altos rendimientos, junto con un método de purificación mejorado para satisfacer las demandas de calidad de los estudios in vivo .

Introduction

Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se han convertido en una herramienta indispensable en la investigación de la terapia génica, ya que ofrecen una combinación única de eficacia y seguridad para^{la administración de} genes. Los métodos tradicionales para generar AAV en entornos de laboratorio han sido fundamentales para avanzar en nuestra comprensión y aplicación de la terapia génica². Sin embargo, estos métodos, si bien son fundamentales, presentan ciertas limitaciones y desafíos, especialmente en términos de rendimiento, eficiencia en el tiempo y la calidad de los vectores producidos, en particular la proporción de partículas llenas y vacías³.

El procedimiento convencional para la producción de AAV consiste principalmente en la transfección de células HEK293⁴. Este proceso, que normalmente se lleva a cabo en placas de cultivo celular, requiere que las células se transfecten con un plásmido que contenga el gen de interés junto con un plásmido auxiliar y un plásmido de cápside AAV ^5,6. Después de la transfección, las células producen partículas AAV, que luego se recolectan y purifican ^5,6. El proceso de purificación a menudo implica ultracentrifugación, un paso crítico en la obtención de vectores AAV de alta pureza⁷. La ultracentrifugación, en particular el uso de cloruro de cesio (CsCl) o gradiente de yodixanol, es un método estándar para separar las partículas de AAV de los desechos celulares y otras impurezas⁸. Este paso es crucial para lograr la pureza y concentración deseadas de los vectores AAV, lo que repercute directamente en su eficacia en la entrega de genes⁸. A pesar de su uso generalizado, la ultracentrifugación tradicional tiene sus inconvenientes. Por ejemplo, el rendimiento de los vectores AAV de este método puede ser variable y, a menudo, bajo, lo que plantea desafíos significativos cuando se necesitan grandes cantidades de vectores de alto título, particularmente para estudios in vivo o modelos animales grandes⁹.

Otro aspecto crítico de la calidad del vector AAV es la proporción de partículas llenas y vacías¹⁰. Las preparaciones de AAV a menudo contienen una mezcla de estas partículas; Sin embargo, solo las partículas completas contienen el material genético terapéutico. La presencia de una alta proporción de partículas vacías puede reducir significativamente la eficiencia de la entrega de genes¹⁰. Por lo tanto, la evaluación y optimización de la proporción de partículas llenas y vacías es un parámetro clave para evaluar la eficacia de los vectores AAV. Los métodos tradicionales, si bien son capaces de producir vectores AAV, a menudo tienen dificultades para controlar esta relación de manera consistente, lo que lleva a variaciones en la potencia del vector¹⁰.

Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células libre de utilizar cultivos celulares de HEK293T intensivos en mano de obra en placas celulares, integrando la partición bifásica de polietilenglicol/acuoso con ultracentrifugación en gradiente de iodixanol. La pureza del vector AAV se confirma mediante SDS-PAGE y tinción de plata, y la proporción de partículas llenas y vacías se determina mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo ¹¹.

Protocol

Los detalles de los reactivos, plásmidos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. La composición de los tampones utilizados se proporciona en el Archivo Complementario 1. 1. Preparación de plásmidos Transformación de plásmidos (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) en E. coli.NOTA: Se puede utilizar cualquier cepa de E. coli para la amplificación de plásmidos. Para algunos plásmidos, las células competentes especiales, como NEB estable, pueden mejorar el rendimiento del plásmido. Los tres plásmidos utilizados en este protocolo son pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 y pAAV-Cap: pAAV-RC6. Cultive las bacterias en medios LB que contengan los antibióticos selectivos adecuados en un volumen óptimo a 37 °C durante 16-18 h.NOTA: Cuando se utilizan células estables NEB, cultivar a 30 °C durante 18-20 h. Recolecta ADN plasmídico centrifugando la E. coli. medio de cultivo a 4000 x g, 4 °C, durante 15 min. Vierta con cuidado el líquido sobrenadante de la botella de centrífuga en un contenedor de residuos y purifique el ADN plasmídico del pellet con un kit de purificación de plásmidos libre de endotoxinas a gran escala.NOTA: Asegúrese de verterlo lentamente y evitar salpicaduras. Mida la concentración y la pureza del ADN con un espectrofotómetro.NOTA: Verifique la pureza del ADN verificando la relación OD260 / OD280 . La proporción de ADN puro es de aproximadamente 1,8. La concentración de ADN debe ser superior a 1 μg/μL para la etapa posterior de co-transfección. Aumente las reservas de glicerol bacteriano añadiendo 500 μL del cultivo durante la noche a 500 μL de glicerol al 50% en un criovial y almacene a -80 °C. 2. Preparación HEK293T células Siembre HEK293T células con medios de alto contenido de glucosa DMEM que contienen un 10% de FBS en una fábrica de células de 10 capas (CF10) y deje que las células crezcan en la incubadora durante la noche.NOTA: Los pasajes de las células 293T deben ser inferiores a 10 para tener las condiciones óptimas para una producción robusta de AAV. Si es posible, no agregue antibióticos a los medios de cultivo en este momento. CF10 tiene aproximadamente 42 veces la superficie de crecimiento de una placa de cultivo celular de 150 mm. Siembre la misma densidad celular en una placa de cultivo celular de 150 mm para permitir verificar el crecimiento celular bajo un microscopio. Prepare una suspensión de celdas de 1075 mL, agregue una suspensión de celdas de 25 mL a un plato de 150 mm y agregue el resto al CF10. Comprobar la confluencia celular al día siguiente antes de la transfección.NOTA: Las células deben alcanzar un 80%-90% de confluencia en el momento de la transfección mediante la observación bajo un microscopio. 3. Triple transfección de plásmidos AAV Calcule la cantidad de cada plásmido necesaria (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotipo) para tener una relación molar de 1,2:1:1 con 2,5-5 mg de ADN total por CF10.NOTA: La proporción molar de los tres plásmidos puede ser variable para una eficacia óptima de la transfección. Es mejor probarlo en un entorno a pequeña escala antes de pasar a este entorno CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 y pAAV-RC6 se utilizan para crear el virus AAV6-CMV-GFP como ejemplo. La fórmula de la calculadora de PEI se enumera en la Tabla 1. Alícuota 350 mL de OptiMEM en un frasco estéril de 500 mL. Agregue los tres ADN plásmidos en el frasco que contiene el Opti-MEM. Mezclar bien. Añadir 15 mL de 1 mg/mL de solución de polietilenimina (PEI) (proporción de 1:3 μg de ADN a μg de PEI). Agite vigorosamente la mezcla de OptiMEM/DNA/PEI hacia arriba y hacia abajo durante 30 s.NOTA: Está bien hacer burbujas. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10-15 min.NOTA: Una incubación más prolongada puede reducir la eficiencia de la transfección. Agregue la solución OptiMEM/DNA/PEI al frasco de 1 L que contiene 700 mL de DMEM bajo en glucosa con 10 mM de HEPES y 2% de FBS. Mezclar bien.NOTA: En este estudio, la glucosa baja en el DMEM mostró una mejor producción de vectores AAV después de la co-transfección. La adición de HEPES ayuda a mantener las células en un mejor estado. Mezcle girando la botella lentamente. Evite crear demasiadas burbujas. Saque el CF10 de la incubadora y aspire los medios y colóquelos en un contenedor de residuos.NOTA: Coloque el CF10 en la superficie dentro de la campana y levante gradualmente un lado hacia arriba, aspire lentamente el medio sin separar las celdas. Agregue con cuidado la mezcla de transfectante al CF10. Asegúrese de que las diez capas estén cubiertas con medios.NOTA: Agregue 25 mL de mezcla de transfectante en el plato de 150 mm. Monitoree las células diariamente hasta la cosecha. Agregue la mezcla de transfectante restante en el CF10 vertiendo lentamente. Gire el CF10 con mucho cuidado y asegúrese de que el volumen sea igual para cada capa. Regrese el CF10 a la incubadora durante 72-96 h.NOTA: Revise la antena del monitor de 150 mm para decidir cuándo cosechar los vectores AAV. Cuando las células se desprenden muy fácilmente con una carga completa de AAV, es el momento de cosechar. 4. Cosecha de vectores AAV Coseche el virus 3-4 días después de la transfección agitando vigorosamente el CF10. Vierta el medio en los tubos cónicos de 250 ml y centrije el virus a 4000 x g durante 20 min a 4 °C.NOTA: Para el serotipo AAV6 utilizado en este protocolo, el 80% de AAV permanecerá unido principalmente al material celular en el pellet. Y el 20% de los AAV fueron secretados a los medios de comunicación. Estas proporciones pueden diferir para otros serotipos de AAV. Filtre el sobrenadante clarificado con una unidad de filtro de 0,45 μm y guárdelo para la precipitación. Enjuague el CF10 con 500 ml de tampón DPBS 1x y centrifugue a 4000 x g durante 20 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío y una pipeta de aspiración. Añadir 20 mL de tampón de lisis AAV por CF10 a -80 °C hasta la purificación.NOTA: Transfiera el lisado de AAV a un tubo cónico de 50 mL para su posterior extracción con AAV. Extraiga el sobrenadante filtrado, agregue una solución de NaCl al 40% de PEG-2.5 M para una concentración final de 8% de PEG e incube en una cámara frigorífica en un rotador orbital durante al menos 3 h o toda la noche.NOTA: Para 100 mL de sobrenadante, agregue 25 mL de solución de NaCl PEG-2.5% al 40%. Precipitar el virus centrifugando a 4000 x g durante 30 min a 4 °C.NOTA: Transfiera la mezcla a tubos cónicos de 250 mL para la centrifugación. Aspire para eliminar el sobrenadante y agregue 5-10 mL de tampón de resuspensión AAV HEPES para suspender los gránulos. Transfiera a un tubo cónico de 50 ml para continuar con la purificación posterior, o guárdelo a -80 °C. 5. Extracción de AAV Descongele el pellet del virus en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 minutos con un agitador.NOTA: Agite el lisado de AAV para que se derrita por completo. Congelar en baño de etanol 100% a -80 °C durante 20-30 min.NOTA: Alternativamente, el ciclo de congelación se puede realizar con un vaso de precipitados frío 100% etanol rodeado de hielo seco. Realice la congelación/descongelación 3-4 veces, y un vórtice en el medio si es necesario.NOTA: Este ciclo se puede pausar en el paso de congelación. Almacene el lisado de AAV a -80 °C hasta el trabajo posterior. Descongele el lisado de AAV (a partir del paso 5.3) y el AAV resuspendido (a partir del paso 4.7)” en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 min con un agitador y un vórtice.NOTA: Asegúrese de derretir completamente y mezclarlo. Añadir benzonesa nucleasa (250 unidades/μL) al lisado de AAV y AAV resuspendido para una concentración final de 50 unidades/mL. Vortex, la solución. Incubar en un baño de agua a 37 °C con agitación durante 30 min.NOTA: Saque las alícuotas de desoxicolato de sodio al 10% en un baño de agua para permitir que el tiempo se disuelva, se caliente y se mezcle bien. Añadir un 10% de desoxicolato de sodio para una concentración final del 0,5% e incubar a 37 °C con un agitador encendido durante 30 min.NOTA: El desoxicolato de sodio se utilizó para mejorar la liberación de AAV de las células. Distribuya la solución cruda de AAV en tubos de centrífuga de 2 ml y centrifuga a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL.NOTA: Utilice una pipeta de 1 ml para transferir el sobrenadante. Deseche los gránulos. Agregue una cantidad igual de cloroformo y extraiga AAV por vórtice durante 1-2 min.NOTA: La solución debe volverse opaca, blanca, parecida a la leche. Transfiera la solución lechosa a tubos de centrífuga de 2 ml y distribúyala uniformemente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C. Pipetea con cuidado la capa rosada superior y transfiérela en un nuevo tubo cónico de 50 ml.NOTA: No altere las capas de cloroformo/proteína. Mida el volumen final con una pipeta. De acuerdo con la tabla de volumen de AAV-PEG-Sulfato crudo (Tabla 2), mezcle los volúmenes apropiados de 50% (NH4)2SO4 y 40% de solución PEG. Vórtice durante 2 min. Transfiera la mezcla a tubos de centrífuga de 2 ml para distribuirla uniformemente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C Recoja la capa inferior con una aguja de 22 g y una jeringa de 3 ml. Recoja el AAV en un tubo cónico de 50 mL y guárdelo a 4 °C para su posterior ultracentrifugación en gradientes de iodixanol. 6. Purificación de AAV por ultracentrifugación en gradiente de yodixanol Prepare los gradientes de yodixanol frescos antes de cargar el AAV de acuerdo con el número de tubos de ultracentrifugación utilizados (Tabla 3).NOTA: Se utilizó rojo de fenol para observar las capas. Superponga cada solución en un tubo de ultracentrífuga de polipropileno redondo de sellado rápido lentamente con una jeringa de 10 ml unida con una aguja larga punteada de 16 G. Evita las burbujas. Agregue con cuidado hasta 17 ml de solución de AAV sobre el gradiente con una jeringa de 22 G. Use un tampón de diálisis AAV para llenar el tubo.NOTA: Agregue la solución de AAV cargando gotas contra la pared en el tubo de ultracentrífuga. No alteres las capas de degradado. Selle los tubos de ultracentrífuga con un sellador eléctrico.NOTA: Equilibrar los tubos antes de enviarlos a ultracentrífuga con ±0,2 g de diferencia. Centrífuga a 350.000 x g durante 2 h en un rotor Ti70 a 4 °C. Retire con cuidado los tubos del rotor y colóquelos en el soporte de tubos de ultracentrífuga.NOTA: Asegúrese de que no se alteren los degradados. Recoja las fracciones de AAV siguiendo los pasos a continuación:Estabilice el tubo en un soporte de soporte. Perfore los tubos de ultracentrífuga ligeramente por debajo de la interfaz del 40%-60% con una aguja de 19 G conectada a una jeringa de 10 mL.NOTA: La abertura de la aguja debe estar hacia arriba, mirando hacia el 40% de pendiente. Haz un agujero en la parte superior del tubo con una aguja de 16 G. Recoja hasta 5 ml por tubo. Evite recoger la contaminación de la proteína en la interfaz 25%-40%. Repita el procedimiento para cada tubo de ultracentrífuga.NOTA: Transfiera las fracciones de AAV a un tubo cónico de 50 mL. 7. Ultracentrifugación de gradientes de yodixanol de segunda ronda NOTA: Este paso es opcional. Este paso consiste en reducir la proporción de AAV vacío para obtener una cápside de AAV completa de mayor calidad. Diluya AAV >1:1 con tampón de diálisis AAV.NOTA: El AAV recogido de la primera ronda de ultracentrifugación tenía una capa de yodixanol del 40%. Debe diluirse al menos en un 50% para poder cargarse encima de la capa de yodixanol del 30%. Superponga cada solución (Tabla 4) en un tubo de ultracentrifugación con una aguja puntada de 16 G y conecte lentamente una jeringa de 10 mL. Evita las burbujas. Agregue con cuidado 20 ml de solución diluida de AAV sobre el gradiente con una jeringa de 22 g. Use un tampón de diálisis AAV para llenar el tubo. Repita los pasos 6.4 a 6.7. 8. Diálisis y concentración de AAV Transfiera el virus AAV al casete de diálisis con una aguja nueva de 18 g y una jeringa de 10 ml. Inyecte lentamente el virus en el casete y elimine el aire del mismo. Añada una barra agitadora al vaso de precipitados que contenga tampón de diálisis AAV y colóquela en una placa agitadora. Coloque el casete de diálisis en el tampón de diálisis con una boya flotante. Agitar a 4 °C. Cambie 2-3 veces el tampón de diálisis AAV.NOTA: Utilice suficiente búfer para permitir que el casete flote y realice el intercambio de búfer. Cubre el vaso de precipitados con papel de aluminio. Con una jeringa de 10 ml conectada con una aguja de 18 g, recoja el virus del casete y colóquelo en una unidad de filtro centrífugo. Centrifugar a 4.000 x g durante 15-30 min a 4 °C.NOTA: Administre el AAV con el tampón de diálisis AAV 2-3 veces. Concentre el AAV hasta que ~ 200 μL de restante estén en la parte superior del filtro. Recoja el AAV concentrado de la unidad de filtro. Enjuague el filtro con otros 300 μL de tampón de diálisis AAV y transfiéralo al AAV concentrado. Filtre el virus a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm con una jeringa deslizante de tuberculina luer de 1 mL. Para asegurar la menor cantidad de pérdida de volumen, use la jeringa de 10 mL para empujar el aire a través del filtro 2-3 veces. Almacene el virus AAV purificado a 4 °C temporalmente para su valoración.NOTA: Titule el virus, alícuota, y almacene a -80 °C en el plazo de 1 semana. 9. Titulación del virus AAV NOTA: Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de TaqMan para valorar el AAV purificado. Tratar los vectores AAV con DNasa I e incubar a 37 °C durante 30 min, luego incubar a 95 °C durante 10 min.NOTA: Como ejemplo de reacción de 10 μL, se utiliza una muestra de virus AAV de 2 μL, 1 μL de DNasa, 1 μL de tampón de DNasa y 6 μL de H2O. Se puede realizar en un termociclador con tubos de PCR. Prepare los juegos de cebadores dirigidos a la región de inserción AAV.NOTA: Los objetivos podrían ser el promotor, el transgén y el reportero en el constructo AAV. Los cebadores se enumeran en la Tabla 5. Prepare patrones de plásmidos de ADN (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 y 0,0001 pg/μL) y un control negativo (H2O). Prepare la mezcla maestra de qPCR, incluidos los cebadores, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque los patrones y las muestras por triplicado en una placa de PCR. Añada la mezcla de qPCR a los estándares y muestras. Selle la placa y realice la reacción qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: Las condiciones de reacción dependen de los materiales/reactivos y del instrumento. Son aplicables ciclos de PCR rápidos y convencionales. Calcular el título del virus AAV.NOTA: La concentración de la muestra en este protocolo es de dilución de 1/10 de las muestras originales. Alicucuota el virus AAV en tubos de 1,5 mL y almacene a 4 °C durante un máximo de un mes y almacene a -80 °C a largo plazo.NOTA: Evite los ciclos de congelación/descongelación para el almacenamiento. Cuando se utilice para experimentos in vivo , no utilice descongelar más de dos veces las alícuotas. 10. Control de calidad de AAV NOTA: La pureza de los virus AAV se caracterizó mediante una tinción de plata SDS-PAGE con un gel SDS-PAGE y se tiñó con un kit de tinción disponible en el mercado. Desnaturalizar 3 x 109 vg de muestra de virus AAV con tampón Laemmli.NOTA: Utilice un virus AAV de referencia como control. Se utiliza la cápside completa de referencia AAV6-CMV-GFP. Cargue el AAV desnaturalizado en un gel SDS-PAGE con un gradiente de 4%-20% y ejecute a 180 V durante 50 min. Retire el gel de la placa de electroforesis. Tiñe el gel con un kit de tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Compruebe las proteínas de la cápside AAV VP1, VP2 y VP3.NOTA: El virus AAV puro contiene solo la proteína de la cápside VP1, VP2 y VP3. Si no son puros, otras bandas de proteínas serían visibles en el gel.NOTA: Se realizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) de viriones AAV recombinantes teñidos negativamente para evaluar la integridad morfológica y la relación lleno/vacío. Tome una rejilla EM con una pinza y siéntese en el banco con el lado brillante de la rejilla hacia arriba. Pipetear 5 μL de muestra de AAV en la rejilla y dejar que se seque por evaporación.NOTA: Diluya el AAV si es necesario. 1012 vg/mL es un título promedio. Puede tardar entre 30 y 60 minutos en secarse la rejilla. Lave la rejilla pipeteando, gota a gota, con unos 200 μL de H2O en la rejilla. Retire el exceso de agua colocando lentamente un papel de cromatografía verticalmente junto a la rejilla. Pipetear 5 μL de solución de acetato de uranilo al 2% en la rejilla. Incubar durante 5 minutos y absorber como se mencionó anteriormente. Deje que la rejilla se seque. Visualice las partículas AAV bajo un microscopio electrónico de transmisión (con un aumento de 50.000 veces). Las cápsidas virales con un genoma viral aparecerán como hexágonos blancos homogéneos, mientras que las cápsidas vacías aparecerán como hexágonos con un borde blanco pero un centro oscuro. Cuente al azar al menos 100 partículas para determinar el porcentaje aproximado de partículas completas vs. partículas vacías de AAV.

Representative Results

En este protocolo detallado paso a paso, se demuestra una plataforma estandarizada para producir virus AAV de alta titulación y alta calidad con el CF10 en un entorno de laboratorio de investigación a gran escala. En comparación con las placas de cultivo celular convencionales, el CF10 proporciona una forma conveniente de cultivar grandes cantidades de células y producir el virus AAV (Figura 1). Se probaron varias condiciones de cultivo para determinar si las células en un entorno óptimo pueden promover la producción viral. Un DMEM bajo en glucosa suplementado con 10 mM de HEPES y 2% de FBS mostró la mejor producción de AAV. Se probaron varios protocolos para purificar los AAV. La mayoría de los procedimientos tienen bajos rendimientos de virus e impurezas de las cápsidos de AAV. Aquí, se desarrolló un protocolo de purificación revisado, combinando el AAV de gránulos celulares y medios de cultivo (Figura 2). Hemos encontrado que el 80% de AAV estaba en las células, y otro 20% de AAV estaba en los medios de cultivo, que fueron secretados por las células. Ambas partes de la AAV se trataron con DNasa para eliminar el ADN libre. El desoxicolato de sodio se utilizó para liberar aún más AAV de las células. A continuación, se extrajeron los AAV con extracción con cloroformo seguida de una partición acuosa en dos fases. Estos pasos permitieron eliminar la mayoría de los contaminantes proteicos. El AAV permanece soluble en la fase de sulfato de amonio. Los contaminantes restantes se eliminaron con una ultracentrifugación discontinua en gradiente de yodixanol (Figura 3A). El gradiente también fue útil para eliminar las cápsides vacías de AAV, especialmente con la segunda ronda de ultracentrifugación en gradiente de yodixanol. La pureza del virus AAV se determinó mediante tinción con plata. Cuando se obtuvieron tres bandas principales correspondientes a la proteína de la cápside AAV, VP1, VP2 y VP3, con una pureza superior al 90%, el virus AAV fue adecuado para uso in vivo (Figura 3B). TEM accedió a la relación entre la cápside llena y la cápside vacía del AAV (Figura 3C). Solo una cápside completa con un inserto de transgén permitiría la expresión del transgén en el tejido objetivo. Una porción alta de la cápside vacía también podría inducir una respuesta inmune a la cápside AAV. Estos controles de calidad son necesarios para cada virus AAV que se produce y purifica antes de su uso. Figura 1: Ilustración esquemática de la producción de AAV mediante el método de triple transfección de células HEK293T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Ilustración esquemática de la purificación de AAV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Purificación de AAV por ultracentrifugación en gradiente de yodixanol y verificación de la pureza del virus AAV. (A) Capas de gradiente de yodixanol y la posición de la aguja para la recolección. (B) Gel representativo que evalúa el contenido y la pureza de la cápside. M: marcador molecular; R: cápside completa de referencia AAV6; S1: cápside AAVDJ de fabricación propia con una ronda de ultracentrifugación; S2: cápside AAVDJ de fabricación propia con dos rondas de ultracentrifugación; S3: cápside AAV6 de fabricación propia. (C) Imagen de microscopía electrónica de AAV. Virus recolectados después de la purificación. Las cápsides virales que contienen un genoma viral aparecen como hexágonos blancos homogéneos, mientras que las cápside vacías aparecen como hexágonos con un borde blanco pero un centro oscuro. Barra de escala: 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Calculadora de PEI para envases de AAV. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 2: Gráfico de volumen bruto de AAV-PEG-Sulfato. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 3: Preparación del gradiente de yodixanol. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 4: Preparación del gradiente de iodixanol de segunda ronda. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 5: Imprimaciones de valoración de AAV. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Ficha complementaria 1: Composiciones de los tampones utilizados para el estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Aquí, se presenta un protocolo técnicamente avanzado para la producción a gran escala de vectores AAV de alto título y alta calidad utilizando una plataforma de fábrica de células (CF10), lo que representa una mejora significativa con respecto a los métodos convencionales de placas de cultivo celular. El uso de fábricas de células simplifica el proceso de cultivo de grandes volúmenes de células, lo que facilita la producción de virus AAV de manera más eficiente¹. Además, al optimizar las condiciones de cultivo, particularmente con DMEM bajo en glucosa suplementado con 10 mM de HEPES y 2% de FBS, se confirmó una producción viral significativamente mejorada, lo que indica el papel crucial del entorno celular en la producción del virus.

El protocolo de purificación revisado, que combina AAV de gránulos celulares y medios de cultivo, aborda el problema común de los bajos rendimientos de virus e impurezas que se observan en muchos protocolos existentes. Los pasos de la extracción con cloroformo y la partición acuosa en dos fases eliminan eficazmente la mayoría de los contaminantes proteicos, y el AAV permanece soluble en la fase de sulfato de amonio. La mejora tanto en el rendimiento como en la pureza de los vectores AAV utilizando la partición bifásica PEG/acuosa combinada con la ultracentrifugación en gradiente de iodixanol, en contraposición a los métodos tradicionales de ultracentrifugación en gradiente, puede atribuirse a una mayor separación inicial con la partición bifásica PEG/acuosa, a una pureza refinada con la ultracentrifugación en gradiente de iodixanol y a la reducción de la copurificación de contaminantes¹². En primer lugar, la introducción de la partición bifásica PEG/acuosa antes de la ultracentrifugación mejora significativamente la separación inicial de las partículas de AAV de los residuos celulares y otros contaminantes. El PEG, un polímero de alto peso molecular, cuando se mezcla con una solución acuosa, crea dos fases distintas¹³. Los vectores AAV tienen una propensión a dividirse preferentemente en una de estas fases (comúnmente la fase rica en PEG), mientras que muchos contaminantes e impurezas se dividen en las otras¹³. Esta partición selectiva concentra eficazmente las partículas de AAV y elimina una parte sustancial de las impurezas incluso antes de la ultracentrifugación, aumentando así el rendimiento y reduciendo la carga contaminante que ingresa a la etapa¹³ de ultracentrifugación. En segundo lugar, la ultracentrifugación en gradiente de yodixanol refina aún más la pureza de los vectores AAV. El yodixanol, un medio de gradiente iso-osmolar no iónico, permite una separación más suave y controlada en comparación con los gradientes tradicionales de CsCl¹⁴. En este gradiente, las partículas AAV migran a una posición en el gradiente que corresponde a su densidad flotante¹⁴. Es importante destacar que este proceso es eficaz para separar las cápsidas completas de AAV (que contienen la carga genética) de las cápsidas vacías (que carecen de material genético), que es un determinante crucial de la calidad del vector. La naturaleza iso-osmolar del yodixanol también preserva la integridad de las cápsidas AAV mejor que los agentes hiperosmolares como el CsCl, lo que podría conducir a mayores rendimientos de vectores intactos y funcionales¹⁴. Por último, los métodos tradicionales de ultracentrifugación, especialmente los que utilizan gradientes de CsCl, a veces pueden copurificar contaminantes que tienen densidades de flotación similares a las de los vectores AAV¹⁵. Al utilizar la partición PEG como paso preliminar, la carga de dichos contaminantes se reduce en gran medida antes de la ultracentrifugación¹³. Esta reducción en la carga contaminante significa que el gradiente de yodixanol puede funcionar de manera más efectiva y selectiva en la purificación de vectores AAV, lo que conduce a una mayor pureza¹⁵.

La pureza y la calidad de los vectores AAV se evalúan rigurosamente mediante tinción con plata y TEM¹¹. La observación de tres bandas principales correspondientes a las proteínas de la cápside AAV VP1, VP2 y VP3, con una pureza superior al 90%, indica la idoneidad de estos vectores AAV para su uso in vivo . El análisis TEM para determinar la proporción de cápside llena a vacía es particularmente crucial, ya que una alta proporción de cápside vacía puede conducir a una reducción de la eficiencia de la entrega de genes y posibles respuestas inmunes¹¹. Este control de calidad, aunque esencial, aumenta la complejidad del procedimiento y puede requerir conocimientos técnicos adicionales.

En conclusión, el protocolo ofrece importantes avances técnicos en la producción de vectores AAV, particularmente en términos de escalabilidad y pureza. Sin embargo, las complejidades asociadas con el proceso de purificación y la necesidad de equipos especializados y experiencia pueden ser una limitación menor para su aplicación en ciertos entornos de investigación. Un mayor refinamiento y simplificación de estas técnicas podría hacer que este enfoque sea más accesible y ampliamente aplicable en el campo de la investigación en terapia génica.

Materials

293T/17 cells	ATTC	CRL-11268
(NH4)2SO4	Millipore Sigma	1.01217.1000
0.5 M EDTA	MilliporeSigma	324506-100ml
1 mL Henke-Ject syringe	Fisher Scientific	14-817-211
10% pluronic F68 solution	Fisher Scientific	24-040-032
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Biorad	1610732
1M HEPES	Fisher Scientific	15-630-080
2% Uranyl Acetate Solution	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4%–20% Precast Protein Gels	biorad	4561094
40% PEG solution	Sigma	P1458-50ML
AAV6 reference full capsids	Charles River Laboratories	RS-AAV6-FL
Accutase Cell Detachment Solution	Fisher Scientific	A6964-100ML
Benzonase	Sigma	E1014-25KU
BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm	Fisher Scientific	12-556-003
Centrifugal Filter Unit	MilliporeSigma	UFC905024
Corning PES Syringe Filters	Fisher Scientific	09-754-29
Dialysis Cassettes, 10 K MWCO	Fisher Scientific	PI66810
Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 µm	Fisher Scientific	FB12566506
Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 µm	Fisher Scientific	FB12566507
Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 µm	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM high glucose	Fisher Scientific	10-569-044
DMEM low glucose	Fisher Scientific	10567022
DNase	NEB	M0303S
DPBS 1x	Fisher Scientific	14-190-250
Fetal Bovin Serum (FBS)	Biowest	S1620
Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu-50
glycerol	Sigma	G5516-1L
KCl	Sigma	P9541-500G
LB agar	Sigma	L2897-250G
LB broth	Fisher Scientific	BP9732-500
MgCL2·6H2O	Sigma	M9272-100G
NEB stable competent cells	NEB	C3040H
Nest Biofactory 10 chamber	MidSci	771302
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	740424
Opti-MEM	Fisher Scientific	31-985-088
OptiPrep Density Gradient Medium	Millipore Sigma	D1556-250ml
pAAV-CMV-GFP	Addgene	105530
pAAV-DJ	Cell BioLab	VPK-420-DJ
pAAV-RC6	Cell BioLab	VPK-426
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Promega	V3011
PEI Max	Polysciences, Inc	49553-93-7
Pen-Strep	Fisher Scientific	15-140-163
Phenol red	Millipore Sigma	1.07242.0100
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	24612
QuickSeal tube	Fisher Scientific	NC9144589
Sodium Chloride	Sigma	1162245000
sodium deoxycholate	Millipore Sigma	D6750-100G
Taqman Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	Beckman Coulter	337922
Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32209