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방법 논문

Isolation, Purification, and Identification of Bacitracin-producing Bacillus licheniformis from Fresh Baces of Healthy Pigs(건강한 돼지의 신선한 배설물에서 바시트라신 생산 Bacillus licheniformis 의 분리, 정제 및 식별)

1.3K 조회수

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DOI:

10.3791/66777

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2024년 5월 31일

 , 

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 건강한 돼지 배설물에서 바시트라신을 생산하는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis )의 분리, 정제 및 식별을 위한 세부 프로세스에 대한 완전하고 포괄적인 설명을 제공합니다.

초록

바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis )와 바시트라신(bacitracin)은 의학, 화학, 양식업, 농업 및 부업 제품 분야에서 거대한 응용 시장과 가치를 가지고 있습니다. 따라서 바시트라신 생산량이 많은 B. licheniformis 를 선택하는 것이 매우 중요합니다. 이 실험 프로토콜에서는 바시트라신의 수율이 높은 바실러스 를 건강한 돼지의 신선한 배설물에서 분리, 정제 및 식별했습니다. 황체소구 균에 대한 2차 대사산물 바시트라신의 억제 효과도 시험되었습니다. 박층 크로마토그래피와 고성능 액체 크로마토그래피는 바시트라신의 정성적 및 정량적 검출을 위해 사용되었습니다. B. licheniformis 의 생리학적, 생화학적 특성은 관련 키트에 의해 결정되었습니다. B. licheniformis 의 계통발생학적 관계는 유전자 염기서열 검출을 사용하여 결정되고 구성되었습니다. 이 프로토콜은 다양한 관점에서 동물의 신선한 배설물에서 B. licheniformis 의 표준 분리, 정제 및 식별 프로세스를 설명하고 소개하여 공장에서 B. licheniformis 및 bacitracin을 대규모로 활용할 수 있는 방법을 제공합니다.

서론

바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)는 피르미쿠테스(Firmicutes)과에 속하는 바실러스(Bacillus)의 일종으로 물, 토양, 동물의 내장 등 다양한 환경에 널리 분포한다1. B. licheniformis는 짧고 튼튼한 막대 모양의 구조를 가지고 있으며 개별적으로 움직입니다2. 군체는 거의 둥글고 둔하며 중앙이 부풀어 오르고 가장자리가 회백색으로 깔끔합니다3. 생장능력과 번식능력이 강하며 단당류, 다당류, 케토스, 유기산 등 다양한 탄소원의 영양소를 흡수하고 활용할 수 있다4. 성장과 발달의 후기 단계에서 B. licheniformis는 휴면 포자 형태로 존재할 수 있으며 bacitracin, lichenysin 및 surfactin과 같은 항균 물질을 생산할 수 있습니다. 또한 영양 결핍 및 극한의 외부 환경에 저항할 수 있습니다5. 명백한 코돈 선호는 없으며 효율적인 분비 시스템은 B. liche....

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프로토콜

모든 실험 절차는 난징 공과 대학 윤리 위원회에 의해 문서화되고 승인되었습니다. 배설물은 약 2년 된 태호모돈( 재료 표 참조)에서 추출한 것으로, 전문적이고 표준적인 돼지 농장에서 자랐습니다.

1. 미디어 준비

  1. Luria-Bertani(LB) 액체 배지: 원뿔형 병에 NaCl 10g, 효모 추출물 분말 5g, 트립톤 10g을 넣고 증류수를 1L에 넣고 저어주고 유리 막대로 녹입니다. 100mL의 배지를 500mL 원뿔형 병으로 옮기고 통기성 밀봉 필름으로 단단히 묶습니다. 121°C에서 오토클레이브에서 20분 동안 멸균합니다( 재료표 참조).
  2. LB 고체 매체: 원뿔형 병에 NaCl 10g, 효모 추출물 분말 5g, 트립톤 10g, 한천 분말 20g을 넣고 증류수를 1L에 넣고 유리 막대로 녹이고 통기성 밀봉 필름으로 단단히 묶습니다. 121°C에서 오토클레이브에서 20분 동안 살균합니다. 매체가 50 ° C로 냉각되면 배지 20mL를 페트리 접시에 붓고 식 힌 다음 거꾸로 보관하십시오.
  3. 바시트라신 발효 배지: 500mL 원뿔형 병에 대....

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결과

이 실험에서는 1001에서 1048까지 번호가 매겨진 건강한 돼지의 신선한 배설물에서 48개의 바실러스 균주를 분리했습니다. 그 중 15 종은 M. luteus에 대해 항균 활성을 가졌습니다. 15개 균주에서 바시트라신의 역가는 표 1과 같이 고성능 액체 크로마토그래피로 측정되었습니다. 그 중 B. licheniformis No. 1026이 21.75 U/mL± 456.35로 가장 높은 바시트라신 역가를 보였기 때문에 후속 실험에서 No. 1026을 선택하였다.

TLC에 의한 식별 결과는 그림 2A에 나와 있습니다. 균주 No. 1026과 bacitracin 표준 용액의 발효 배액에서 주요 반점의 위치는 동일했으며 Rf 값은 0.61이었다. HPLC 분석에서 바시트라신의 표준 곡선 방정식은 y = 50.287x -.......

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토론

B. licheniformis는 간단한 배양 조건과 빠른 설탕 소비로 빠르게 성장하며 성숙한 발효 기술은 산업 생산 비용을 절약하는 데 도움이됩니다13. B. licheniformis와 그 분비물인 bacitracin의 광범위한 적용은 유망한 시장 가치를 결정했습니다. 농업에서 B. licheniformis는 토양 비옥도를 높이고 뿌리 발달을 촉진하며 유기물의 분해를 지원함으로써 식물 성장과 영양 흡수를 개선하기 위한 생물 비료로 사용됩니다15. 산업용 효소 생산을 위해 B. licheniformis는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 및 리파아제와 같은 다양한 효소를 생산하며, 이는 식품 가공, 세제 제조, 가죽 가공 및 섬유 산업에서 대체할 수 없는 시장 가치를 결정합니다16

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(National Key Research and Development Program of China, No. 2022YFC2104800)과 장쑤성(江蘇省)의 Six Talent Peaks Project(제2019-NY-058호)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2 × Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP252-01
2kb DNA 마커Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국BM121-01
AcetonitrileShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국A104443
한천 분말Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국A800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA104062
황산 암모늄 ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10002917
오토클레이브 살균기Zealway Instrument Inc., Xiamen, ChinaGI36DWS
바실러스 생화학 식별 스트립칭다오 Haibo Biotechnology Co., Ltd., 칭다오, 중국HBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., 상하이, 중국B65740
박테리아 DNA 추출 키트Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., 베이징, 중국DP209
통기성 밀봉 필름Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
부탄올상하이 Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국B433378
C18 (5 μ m, 4.6 × 250 mm) HPLC 컬럼Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, ChinaC1805-462510
탄산칼슘 (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10005717
CentrifugeNew Brunswick Scientific Co., Inc., UK5452
크로마토그래피 탱크 Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP-1
원뿔형 병Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China18012
항온 인큐베이터Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, ChinaGH4500
인산이칼륨 (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, ChinaXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국E397526
전자 저울Mettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
에틸 알코올Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국E130059
젤 미디 정제 키트Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., 베이징, 중국DP302
유리 막대Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
GlucoseShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaD823520
Gram의 염색 용액 키트Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHB8278
고성능 액체 크로마토 그래프Agilent Technologies, Inc., California, America1260
수평 전기 영동 장치Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국DYCP-31DN BIOMATE
접종 링Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., 상하이, 중국3171026
Magnetic stirrerWiggens GmbH Co., Ltd., GermanyWH220 PLUS
메틸 알코올Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaM116115
마이크로 원심 분리기 튜브Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., 상하이, 중국1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, 쑤저우, 중국BNCC102589
미세 다공성 필터 멤브레인Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
닌히드린상하이 알라딘 생화학 기술 유한 회사, 상하이, 중국N105629
광학 현미경광학 기기 공장, 상하이, 중국DYS-108
돼지 배설난징 Quanfu 돼지 농장, 난징, 중국
중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭기Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., 쑤저우, 중국ETC811
전문 시퀀싱 회사General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
PyridineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaP111516
ShakerTaicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, ChinaHYL-C
실리카겔 GF254 박층 플레이트Yantai Huayang New Material Co., Ltd., 중국 옌타이HPT-HSGF5025023
염화나트륨(NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS805275
구연산나트륨Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., 중국 상하이C39197100001
가용성 전분Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., 중국 상하이S817547
서모스탯 수조Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaDK-8D
TryptoneShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, ChinaGR501-01
초순수 기기Merck KGaA Co., Ltd., GermanyMilli Direct-Q8
초음파 세척기Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, ChinaSB-100DT
버니어 캘리퍼스;Sanfeng Company, 일본N20P
효모 추출물 분말Vicbio Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국LP0021
물

참고문헌

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A.

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