ЛПС и АТФ-индуцированная гибель PMA-дифференцированных макрофагов THP-1 и ее валидация
Summary
Этот протокол основан на ЛПС и АТФ-индуцированной гибели PMA-дифференцированных макрофагов THP-1. Мы используем проточную цитометрию для анализа аннексина V и двойное окрашивание 7-AAD для выявления гибели клеток, используя всю клетку и сканирующую электронную микроскопию для наблюдения за морфологией клеточной мембраны.
Abstract
Гибель клеток является фундаментальным процессом во всех живых организмах. Протокол устанавливает индуцированное липополисахаридом (ЛПС) и аденозинтрифосфатом (АТФ) дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. ЛПС в сочетании с АТФ является классическим методом индукции воспаления, часто используемым для изучения пироптоза, но апоптоз и некроптоз также реагируют на стимуляцию ЛПС/АТФ. В нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется только во внутреннем листке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза клеточная мембрана остается неповрежденной и подвергается воздействию фосфатидилсерина, а на более поздних стадиях клеточная мембрана теряет свою целостность. Здесь с помощью проточной цитометрии анализировали двойное окрашивание аннексина V и 7-аминоактиномицина D (AAD) с целью выявления гибели целых клеток. Результаты показывают, что значительные клетки погибли после стимуляции ЛПС/АТФ. С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдаем возможные формы клеточной гибели в отдельных клетках. Результаты показывают, что клетки могут подвергаться пироптозу, апоптозу или некроптозу после стимуляции ЛПС/АТФ. Этот протокол направлен на наблюдение за гибелью макрофагов после стимуляции ЛПС/АТФ. Результаты показали, что гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ не ограничивается пироптозом и что апоптоз и некротический апоптоз также могут происходить, что помогает исследователям лучше понять гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ и выбрать лучший экспериментальный метод.
Introduction
Гибель клеток является фундаментальным физиологическим процессом во всех живых организмах. В последние годы серьезные исследования показали, что гибель клеток влияет на иммунитет и баланс в организме. Изучение клеточной смерти помогает нам лучше понять возникновение и развитие заболеваний. Было описано несколько форм запрограммированной клеточной смерти, и были определены некоторые ключевые мишени в этих процессах. Пироптоз, апоптоз и некроптоз являются тремя генетически определенными запрограммированными путями гибели клеток, участвующими во внутреннем балансеи заболевании.
Пироптоз характеризуется образованием мембранных пор и выделением содержимого клеток. Активированные каспазы или гранзимы расщепляют гасдермины, разделяя их N-концевые домены, которые затем олигомеризуются, связываются с мембраной и образуют поры 2,3,4. Пора гасдермина обеспечивает атипичный канал секреции через клеточные мембраны, что приводит к нисходящим реакциям клеток, включая высвобождение содержимого и приток ионов 2,3,4. В конечном счете, клетки в конечном итоге испытывают разрыв плазматической мембраны и пироптотический лизис, чему способствует нинджурин-15. При апоптозе активированные Bax и Bak образуют олигомеры на внешней мембране митохондрий и высвобождают цитохром С, который регулируется балансом между проапоптотическими и антиапоптотическими белками семейства BCL-2, инициирующими каспазами (каспазами-8, -9 и -10) и эффекторными каспазами (каспазами-3, -6 и -7)1,6,7. Морфологические изменения апоптоза включают блеббинг мембраны, усадку клеток, фрагментацию ядер, конденсацию хроматина и образование апоптотических тел 6,8. Рецептор-взаимодействующая серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIPK3) и доменоподобная киназа смешанной линии (MLKL) являются двумя основными компонентами механизма некроптозы1. RIPK3 рекрутирует и фосфорилирует MLKL, p-MLKL олигомеризуется, связывается с клеточной мембраной, инициирует перфорацию мембраны, вызывает приток ионов, увеличивает внутриклеточную осмолярность и, в конечном итоге, разрыв клетки 6,9. Гасдермины и MLKL связываются с плазматической мембраной и опосредуют пироптоз и некроптоз соответственно, в то время как BAX/BAK опосредует апоптоз, связываясь с внешней мембраной митохондрий.
Хотя каждый путь имеет определенные механизмы и результаты, они приводят к аналогичным изменениям на клеточной мембране. В нормальных условиях фосфатидилсерин (ФС) локализуется только во внутренней створке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза ФС будет подвергаться воздействию за пределами плазматической мембраны. Каспазы-3/каспазы-7 активируют семейства TMEM16 и XKR, что приводит к асимметричной клеточной мембране и экстернализирует PS во время апоптоза10. D-опосредованный гасдермином и MLKL-опосредованный притокCa2+ приводит к потере симметрии фосфолипидного бислоя на клеточной мембране и облучению PS. Воздействие происходит до потери целостности клеточной мембраны11,12. Основываясь на схожих изменениях в мембране этих трех типов запрограммированной клеточной гибели, мы используем проточную цитометрию для анализа двойного окрашивания аннексина V/7-аминоактиномицина D (7-AAD) для выявления клеточной гибели. Аннексин V, кальций-зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладает высоким сродством к PS, который может служить чувствительным зондом для обнаружения экспонированного PS на поверхности плазматической мембраны13. 7-AAD представляет собой краситель нуклеиновой кислоты, который не может пройти через всю клеточную мембрану. Он похож на йодид пропидия (PI), широко используемый краситель нуклеиновой кислоты. Они имеют схожие флуоресцентные характеристики, но 7-AAD имеет более узкий спектр излучения и меньше помех другим каналам обнаружения. Из-за этих сходств недостаточно различать пироптоз, апоптоз и некроптоз. Мы использовали проточную цитометрию для обнаружения гибели клеток из целых клеток. Второй метод используется для захвата клеточной мембраны с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для наблюдения за возможными формами клеточной гибели в отдельных клетках.
Мы установили липополисахаридное (ЛПС) и аденозинтрифосфат (АТФ), индуцированное форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА)-дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. Этот протокол сосредоточен на наблюдении за гибелью клеток, а не на исследовании механизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной рукописи были использованы два метода для выявления ЛПС и АТФ-индуцированной гибели РМА-дифференцированных макрофагов ТГП-1. Использовали двойное окрашивание аннексином V/7-AAD, результаты которого анализировали с помощью проточной цитометрии из общего окрашивания. Как и при др…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь и Лу Яну из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении проточной цитометрии, Цуйпин Чэню из Государственной ключевой лаборатории ресурсов юго-западной китайской медицины за помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [82104491], Фондом естественных наук провинции Сычуань [2023NSFSC0674] и Фондом постдокторантуры Китая [2021M693789].
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
References
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
- Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
- Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
- Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
- Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
- Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
- Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
- Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
- Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
- Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
- JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
- Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
- Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
- Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
- Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
- Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
- Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
- Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
- Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
- Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
- Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
- Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
- Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
- Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).
