In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris
Summary
Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.
Abstract
Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution. La méthode consiste à implanter une fenêtre d'imagerie crânienne, l'injection d'un colorant fluorescent de calcium indicateur qui peut être repris par un grand nombre de neurones et finalement d'enregistrer l'activité des neurones à l'imagerie calcique laps de temps en utilisant une in-vivo deux microscope photonique. La co-injection des astrocytes spécifiques colorants permet de différencier les neurones à partir des astrocytes. La technique peut être réalisée sur des souris exprimant des molécules fluorescentes dans les sous-populations spécifiques de neurones pour mieux comprendre les interactions en réseau des différents groupes de cellules.
Protocol
Discussion
L'avantage de cette méthode sur des enregistrements électrophysiologiques, c'est qu'il est moins invasive et permet l'enregistrement de l'activité neuronale dans les denses réseaux de neurones. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de prendre un soin extrême lors de l'exécution de la craniotomie pour ne pas endommager la mère. Même une petite quantité de saignement sous-dural avec énormément obscurs de l'imagerie.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Olga Garaschuk pour des discussions utiles sur l'optimisation du chargement en vrac des indicateurs de calcium.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
