मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में Mitochondrial परिसर गतिविधि के लिए जांच
Summary
इस वीडियो में, हम आपको बताएंगे कि कैसे मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों जेल गतिविधि assays में उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
Mitochondria cytoplasmic organelles कि सेलुलर चयापचय और homeostasis में एक प्राथमिक भूमिका है, सेल संकेतन नेटवर्क के विनियमन, और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु. Mitochondria उत्पादन एटीपी, cytoplasmic redox राज्य और सीए 2 + संतुलन को विनियमित, फैटी एसिड catabolize, heme, nucleotides, स्टेरॉयड हार्मोन, अमीनो एसिड synthesize, और प्रोटीन में लोहे सल्फर समूहों को इकट्ठा में मदद. Mitochondria भी गर्मी के उत्पादन में एक आवश्यक भूमिका है. Mitochondrial जीनोम के उत्परिवर्तन मानव विकार के कई प्रकार के कारण. mtDNA परिवर्तन के संचय उम्र बढ़ने के साथ संबद्ध है और कैंसर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका का संदेह है. सभी प्रकार की कोशिकाओं में उनके vitally महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, mitochondria के समारोह में भी स्टेम सेल के लिए महत्वपूर्ण होना चाहिए. प्रमुख अग्रिम स्टेम सेल व्यवहार्यता, प्रसार, और भेदभाव की क्षमता के बारे में हमारी समझ में बनाया गया है. लेकिन स्टेम कोशिकाओं के कार्यात्मक गतिविधि, विशेष रूप से अपनी ऊर्जा की स्थिति में, अभी तक नहीं विस्तार में था अध्ययन किया गया. लगभग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और उनके विभेदित अग्रदूत संतान के mitochondrial गुणों के बारे में कुछ नहीं जाना जाता है. एक को समझने और hESC समारोह और विकास क्षमता में mitochondria की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए सीधे mitochondrial श्वसन परिसरों के गतिविधि को मापने है. यहाँ, हम उच्च संकल्प स्पष्ट देशी जेल और जेल पांच hESCs की सांस श्रृंखला परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक विधि के रूप में गतिविधि के दृश्य में वैद्युतकणसंचलन बाद का वर्णन.
Protocol
Discussion
इस वीडियो में, हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, उच्च संकल्प स्पष्ट देशी जेल वैद्युतकणसंचलन (hrCNE) द्वारा उनकी जुदाई, और बाद में जेल उत्प्रेरक गतिविधि assays द्वारा विश्लेषण से mitochondrial प्रोटीन परिसरों की निकासी का वर्णन क?…
Acknowledgements
Teitell प्रयोगशाला में मानव भ्रूण स्टेम सेल के अध्ययन वर्तमान में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) बीज अनुदान RS1 00,313 द्वारा समर्थित हैं. हम इन और अतिरिक्त अध्ययन में सलाह और अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए डा. कार्ला (UCLA) Koehler और Koehler प्रयोगशाला के सदस्यों धन्यवाद.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
