في هذا الفيديو ، وسوف نظهر لكم كيف يمكن تحليل السلسلة التنفسية الميتوكوندريا مجمعات بشرية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في المقايسات النشاط هلام.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات السيتوبلازمية التي لها دور أساسي في عملية الأيض الخلوية والتوازن ، وتنظيم شبكة الخلية إشارات ، وموت الخلايا المبرمج. الميتوكوندريا إنتاج ATP ، وتنظيم الدولة وحشوية الأكسدة CA2 ميزان + ، يقوض الأحماض الدهنية ، واصطناع الهيم ، النيوكليوتيدات ، وهرمونات الستيرويد ، والأحماض الأمينية ، وتساعد على تجميع الحديد والكبريت في مجموعات البروتينات. الميتوكوندريا أيضا أن يكون له دور أساسي في إنتاج الحرارة. الطفرات للجينوم الميتوكوندريا تسبب عدة أنواع من اضطراب الإنسان. تراكم الطفرات و mtDNA يرتبط مع الشيخوخة ، ويشتبه في أن لها دورا هاما في تطور السرطان. نظرا لدورها المهم جدا في جميع أنواع الخلايا ، يجب أن يكون وظيفة الميتوكوندريا أيضا أن تكون حاسمة للخلايا الجذعية. وقد تم إحراز تقدم رئيسي في فهمنا للبقاء الخلايا الجذعية ، والانتشار ، والقدرة على التمايز. ولكن النشاط الوظيفي للخلايا الجذعية ، وبخاصة الوضع الطاقة لديها ، لم يتم بعد دراستها بالتفصيل. ولا يعرف شيء تقريبا عن خصائص الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وذريتها السلائف متباينة. طريقة واحدة لفهم وتقييم دور في وظيفة الميتوكوندريا hESC والتنموية المحتملة لقياس مباشرة نشاط المجمعات التنفسي الميتوكوندريا. هنا ، نحن تصف قرار واضح عالية هلام إستشراد الأصلية واللاحقة في التصور النشاط هلام كوسيلة لتحليل خمسة مجمعات سلسلة من hESCs الجهاز التنفسي.
Protocol
قرار واضح عالية Electophoresis جل الأصلية (hrCNE) لمجمع الميتوكوندريا فحوصات النشاط في جل واستمرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على أحادي الطبقة من ˠ – المشع أو mitomycin الليفية الماوس C – تعامل الجنينية (MEFs) ، ثم تحولت إلى النمو على Matrigel …
Discussion
في هذا الفيديو ، ووصف لنا استخراج البروتين المجمعات الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، والانفصال عن طريق قرار واضح عالية هلام إستشراد الأصلي (hrCNE) ، وتحليل لاحق من قبل في جل المقايسات نشاط الحفاز. hrCNE يحل مجمعات البروتين غشاء الميتوكوندريا في قرار مشابه لذلك من …
Acknowledgements
معتمدة حاليا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الدراسات في المختبر Teitell بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح البذور RS1 – 00313. نشكر الدكتور كارلا كولر (جامعة كاليفورنيا) وأعضاء المختبر كوهلر عن تقديم المشورة والرؤى في هذه الدراسات وإضافية.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
0.5M EDTA
Fisher Scientific
BP120-1
adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl
Sigma
S3014-500MG
1M Sodium succinate
Fisher Scientific
S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2
Fisher Scientific
BP332-1 and BP329-1
Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)
EMD
9010
store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0
Sigma
I-2399
store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4
Fisher Scientific
BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)
Fluka
44205-500MG
Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)
Fluka
37008-1G
Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid
Fluka
07260-100G
store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution
Sigma
P-3504 and G6279-1L
0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate
Fluka
30970-25G
Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)
TCI America
P0083
Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)
Amresco
0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)
TCI America
D0078
Pb(NO3)2
Fisher Scientific
L62-100
MgSO4
Fisher Scientific
BP213-1
Tris base
Fisher Scientific
BP152-10
Glycine
Fisher Scientific
G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)
Sigma
A2383-5G
Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form
Khvorostov, I., Zhang, J., Teitell, M. Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (16), e724, doi:10.3791/724 (2008).