In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri
Summary
Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.
Abstract
Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) keşif dramatik rejeneratif tıp ilgilenen tıp bilim adamları, mevcut araçları arttı. Ancak, canlı organizmaların içine hESC ayırt hESC ve hücrelerin doğrudan enjeksiyon şimdiye kadar önemli hücre ölümü, teratom oluşumu ve konağın bağışıklık ret engel olmuştur. Naklinden sonra in vivo hESC davranışı anlamak roman görüntüleme teknikleri boyuna hESC lokalizasyonu, proliferasyon ve canlılığı izlemek için gereklidir. Moleküler görüntüleme araştırmacılar, gün boyunca in vivo hücre çoğalması, haftalar ve hatta aylar izlemek için yüksek verimli, ucuz ve duyarlı bir araç vermiştir. Bu gelişme, uzay-zamansal hESC engraftman, yayılması ve yaşayan kişilerde teratom oluşumu kinetiği anlayışı önemli ölçüde artmıştır.
Moleküler görüntüleme alanında önemli bir ilerleme noninvaziv raportör gen deneyleri, in vivo ve çok amaçlı görüntüleme platformlar moleküler ve hücre biyolojisi uzantısı olmuştur. Bu muhabir genler, konak hücre s transkripsiyonel makine yararlanmak mühendislik rehberleri ve arttırıcılar kontrolü altında, vektör ve vektörel olmayan yöntemleri kullanarak çeşitli hücre içine tanıtıldı. Muhabiri genler hücre kullanılan organizatörü türüne göre, biyolojik veya hücresel belirli şartlar altında ya yapısal ya da sadece transkripsiyonu olabilir. Biyoaktif proteinlerin içine muhabiri genlerin transkripsiyon ve tercümesi sonra D-luciferase gibi sinyal üreten problar kullanılarak hassas, noninvaziv enstrümantasyon (örneğin, CCD kamera) ile tespit edilir.
Floresan görüntüleme için gerekli olan kök hücrelerin in vivo olarak izlemek için eksitatör ışık için ihtiyaç önlemek için, biyoparlaklık muhabiri gen görüntüleme sistemleri, ışık emisyon ikna etmek için sadece bir Eksojen olarak uygulanan prob gerektirir. Firefly lusiferaz, ateşböceği Photinus pyralis türetilen, optik olarak aktif metaboliti, oxyluciferin D-luciferase katalize bir enzim kodlar. Optik faaliyet, daha sonra harici bir CCD kamera ile takip edilebilir. Stabil muhabir taşıyan hücreler kendi kromozomal DNA'da inşa transduced muhabiri hESC hayatta kalma ve in vivo çoğalması boyuna izlenmesi için izin kızı hücrelerinin DNA inşa geçecek. Ayrıca, muhabir gen ürünü ifade sinyal üretimi için gerekli olduğundan, tek uygun anne-baba ve kızı hücreleri biyoparlaklık sinyal yaratacak, apoptotik ya da ölü hücrelerden olmaz.
Bu video, özel malzemeler ve biyoparlaklık görüntüleme izleme kök hücre çoğalması ve teratom oluşumu için gerekli yöntemler ele alınacaktır.
Protocol
Discussion
PET ve MRI gibi diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, biyoparlaklık sınırlı mekansal çözünürlükte ve nispeten zayıf fotonların enerji (2-3 eV) nedeniyle azalmış doku penetrasyonu; bu nedenden dolayı şimdiye kadar büyük hayvanlara uygulanabilir değil. Ancak, biyoparlaklık in vivo kök hücre küçük hayvanlar izleme için son derece cazip, düşük maliyetli, yüksek verim ve non-invaziv olma avantajına sahiptir. PET ve floresan yapıları gibi Sigara biyoparlaklık muhabiri genler lusiferaz ile birlikte, b…
Acknowledgements
Tim Doyle, Doktora ve Stanford biyoparlaklık görüntüleme ile yardım için Vivo Görüntüleme Merkezi sayesinde. Ayrıca matris çözümü ile kök hücre ko-enjeksiyon tekniği paylaşmak için Ngan Huang, doktora teşekkür eder. Son olarak, Steve sayesinde Keçe, Doktora veterinerlik hayvan bakımı ile ilgili yardım için.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17 (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. . Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , .
