in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの
Summary
幹細胞治療への関心の高まりとともに、分子イメージング技術は、移植後の幹細胞の挙動のモニタリングに最適です。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、細胞の生存、場所、およびin vivoでの増殖の非侵襲的、反復的な評価を可能にした。このビデオでは、生きたマウスでのヒトES細胞の増殖を追跡する方法を説明します。
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）の発見は劇的に再生医療に興味のある医学者が利用できるツールが増えています。しかし、生体に、ヒトES細胞から分化したヒトES細胞、および細胞の直接注入は、これまで顕著な細胞死、奇形腫形成、および宿主の免疫拒絶反応によって妨げられている。移植後のin vivoでヒトES細胞の行動に理解することは新たなイメージング技術は、長手方向にhESCのローカライズ、増殖、および生存率を監視する必要があります。分子イメージングは、調査官の数日、数週間、さらには数ヶ月にわたってin vivoでの細胞増殖に追跡するための、ハイスループットで安価、かつ高感度な手段を与えている。この進歩は著しくhESCの生着、増殖、そして生きている被験者におけるテラトーマ形成の時空間動態の理解を増加している。
分子イメージングにおける大きな進歩は、生体内でのマルチモダリティ画像処理プラットフォームへの分子細胞生物学から非侵襲的なレポーター遺伝子アッセイの拡張となっています。これらのレポーター遺伝子は、宿主細胞の転写機構を利用する人工プロモーターとエンハンサーの制御下、ベクトルおよび非ベクトルの様々な方法を用いて細胞に導入されています。一度セルに、レポーター遺伝子が使用されるプロモーターの種類に応じて、特定の生物学的または細胞の条件の下で恒常的にまたはいずれか一方のみ転写することができます。生理活性タンパク質へのレポーター遺伝子の転写と翻訳は、その後、D -ルシフェリンのような信号を発生するプローブを使用して機密情報、非侵襲的計測機器（例えば、CCDカメラ）で検出される。
蛍光イメージングのために必要とされるin vivoで幹細胞を追跡するために、興奮性、光の必要性を避けるために、生物発光レポーター遺伝子イメージングシステムは、発光を誘導するだけ外因的に投与プローブが必要です。ホタルPhotinusスピラリスから派生したホタルルシフェラーゼは、光学活性代謝物、オキシルシフェリンにD -ルシフェリンを触媒する酵素をコードしている。光学活性を、外部のCCDカメラで監視することができます。安定してレポーターを運ぶ細胞はその染色体DNA内に構築形質レポーターがin vivoでのヒトES細胞の生存や増殖の長手方向の監視を可能にする、娘細胞にDNAを構築渡します。レポーター遺伝子産物の発現は、信号の生成に必要となるためさらに、唯一の現実的親と娘細胞は、生物発光のシグナルを作成します。アポトーシスまたは死細胞はしません。
このビデオでは、生物発光イメージングによる追跡幹細胞の増殖と奇形腫形成に必要な特定の材料および方法について説明する。
Protocol
Discussion
PETやMRIなどの他のモダリティに比べて、生物発光は、限られた空間分解能と放出された光子の比較的弱いエネルギー（2-3 eV）のために少なく組織の浸透があり、これらの理由から、それはこれまで大規模な動物には適用されていない。しかし、生物発光は、小動物の追跡生体の幹細胞のためのそれは非常に望ましいこと、低コスト、高スループット、および非侵襲性という利点があります。 PETや蛍光構造?…
Acknowledgements
ティムドイル博士と生物発光イメージングの支援のためのin vivoイメージングのためのスタンフォードセンターに感謝します。また、マトリックス溶液と幹細胞の共同注射で彼女のテクニックを共有するためのパンガン黄、博士のおかげ。最後に、スティーブのおかげで、博士号を取得してフェルト獣医、動物のケアと支援のための。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |
References
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