Nötrofiller inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasında olup, görevlerini ve mekanizmalar in vitro yoğun çalışmalar yapılmıştır. Biz piyasada bulunan ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir.
Abstract
Polimorfonükleer nötrofil granülositler (PMN), insanlarda ve inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasındaki en bol lökosit vardır. Inflamasyon kilit rol nedeniyle, hareketlilik, sitokin üretimi, fagositoz ve tümör hücre mücadele gibi nötrofil işlevlerini yoğun olarak çalışılmaktadır. Nötrofil kısa ömürlü ve toplama 2-4 saat içinde kullanılması gereken bu yana özellikle nötrofil özel fonksiyonlar karakterize için diğer kan hücreleri ayırarak, temiz, hızlı ve güvenilir bir yöntem, in vitro çalışmalar için arzu edilir. Burada, piyasada bulunan sodyum metrizoate ve Dextran'ın 500 karışımı ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılması ve kalıntı eritrositlerin parçalanması üzerine katman tam kan oluşur. Hücreler daha sonra, yıkanmış, sayılır ve istenilen konsantrasyon için tampon yeniden süspanse. Doğru yapıldığında, bu yöntem>>% 95 canlılığı% 95 nötrofil örnekleri verim görülmüştür.
Protocol
Nötrofil İzolasyon Protokolü Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirin. 5.0 ml santrifüj tüpüne nötrofil izolasyon medya toplayın. Ayrılması medya üzerindeki kan dikkatlice katman 5.0 ml. Yavaş ve dikkatli bir şekilde ve medya yüzeyine yakın kan ve medya karışmasını önlemek için pipet ile bu adımı gerçekleştirin. 20-25 dakika süreyle 35 500 RCF santrifüjleyin ° C Plazma, monositler, izolasyon medya, nötrofiller, daha fazla izolasyon medya ve kırmızı kan h?…
Discussion
Yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi tam kan sodyum metrizoate ve Dextran'ın 500 karışımı kullanarak insan nötrofil izole etmek için kullanılır. Bu yöntem, nötrofil ayrılması için Ferrante ve Thong (1980) tarafından güncellenmiştir Boyum (1968) tarafından mononükleer lökosit ayırma yöntemi dayanıyor.
Bir bağış toplama sonra, tam kan, EDTA, sitrat veya heparin ile antikoagüle olabilir. Kısa ömürlü olduğundan, nötrofil toplama 2-4 saat içinde kullanılmalıdır. Prosedür yoğunluk gradiyenti ort…
Acknowledgements
NIH R01 HL56621 fon.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Lymphocyte Poly(R)
Reagent
Cedarlane Labs
PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride
Reagent
Invitrogen Gibco
Human Serum Albumin
Reagent
ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer
Reagent
Roche Diagnostics
Centrifuge
Tool
Vortexer
Tool
Pasteur Pipettes and bulb
Tool
PolymorphprepTM
Reagent
Axis-Shield PoC
Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter
기타
Millipore
SLGV033RS
Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride