דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס
Summary
סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס, הוא לטעון את המקור הנוח ביותר עבור כמויות גדולות של דם של חסרי חוליות כלשהו. דם היא פשוטה בהרכב, כאשר רק סוג תא אחד במחזור כללי, amebocyte פרטנית, ורק שלושה חלבונים בשפע בפלסמה, hemocyanin, C-reactive חלבונים, α2-macroglobulin. הדם נאסף מן הלב ותאי דם פלזמה מופרדים על ידי צנטריפוגה.
Abstract
סרטן פרסה יש את המערכת החיסונית ביותר מאופיין של חסרי חוליות חיים ארוכים כל. המחקר של חסינות סרטני הפרסה כבר בהנחייתם של הקלות באיסוף כמויות גדולות של דם מן הפשטות של הדם. סרטנים Horseshoe להציג רק סוג תא בודד במחזור כללי, amebocyte פרטנית. פלזמה יש את מליחות מי הים ורק שלושה חלבונים בשפע, hemocyanin, החלבון הנשימה, C-reactive חלבונים, אשר לתפקד חורבן cytolytic של תאים זרים, כולל תאים חיידקיים, ו-α2 macroglobulin, אשר מעכב את פרוטאזות של פתוגנים הפולשים. הדם נאסף על ידי לנקב לב ישיר בתנאים למזער את הזיהום על ידי lipopolysaccharide (רעלן פנימי aka, LPS), תוצר של חיידקים גראם שליליים. חיה גדולה יכולה להניב 200-400 מ"ל של דם. לצורך המחקר של הפלזמה, כדוריות דם יוסרו באופן מיידי על ידי צנטריפוגה מ פלזמה ו הפלזמה אז יכול להיות מופרדים לחלבונים המרכיבים אותה. בתאי הדם נלמדים בנוחות במיקרוסקופ על ידי איסוף כמויות קטנות של דם לתוך מלוחים LPS-free איזוטוני (0.5 M NaCl) בתנאים המאפשרים בדיקה מיקרוסקופית ישירה על ידי הצבת אחד יותר LPS-free coverglasses על פני צלחת תרבות, אז גובר אלה coverglasses בתאי תצפית פשוטה הבאה מצורף התא. הכנה שנייה תצפית ישירה היא לאסוף 3-5 מ"ל של דם בכלי LPS ללא עובר ואז explanting שברי amebocytes מצטברים לחדר כי כריכים הרקמה בין השקופיות לבין coverglass. בהכנה זו, amebocytes ניעתי נודדים על פני השטח coverglass, שבו הם יכולים בקלות להיות שנצפו. מערכת קרישת הדם כרוכה צבירה של amebocytes ואת היווצרות קריש תאית של חלבון, coagulin, אשר שוחרר מן גרגרי הפרשה של כדוריות הדם. אנליזה ביוכימית של כדוריות דם שטף מחייבת צבירה degranulation אינה מתרחשת, אשר יכול להתבצע על ידי איסוף דם לתוך 0.1 כרכים של 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, M ואחריו צנטריפוגה של התאים כביסה עם 0.5 NaCl.
Protocol
Discussion
ישנם ארבעה מינים של סרטנים פרסה, פוליפמוס Limulus מן החוף המזרחי של צפון אמריקה שלושת המינים נע בין יפן מפרץ בנגל. החיה מזוהה "מאובן חי" בגלל צורות דומות מבחינה אנטומית נמצאו מאובנים כמו 445,000,000 שנים 27. סרטן פרסה מייצג חיה חיים ארוכים, הדורשים 10-13 שנים כדי להגיע לבגרות ?…
Acknowledgements
מחקר מקורי שתוארו לעיל נתמך על ידי NSF מענק 0344630.
References
- Lochhead, J. H., Brown, F. A. Selected Invertebrate Types. , 360-381 (1950).
- Shuster, C. N. The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review. US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , (1978).
- Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga. Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).
- Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties. J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).
- Levin, J., Ornberg, R. L., Cohen, W. D. Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology. , 259-260 (1985).
- Liang, S. M., Liu, T. Y. Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).
- Soderhall, K., Smith, V. J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution. Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).
- Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes. Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).
- Armstrong, P. B., Rickles, F. R. Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte. Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).
- Iwanaga, S., Kawabata, S., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. 3, (1998).
- Armstrong, P. B. The American Horseshoe Crab. , 288-309 (2003).
- Iwanaga, S. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).
- Levin, J. The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems. Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).
- Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria. J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).
- James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).
- Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab. J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).
- Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer. , 276-17796 (2001).
- Armstrong, P. B. A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins. J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).
- Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).
- Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot. Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).
- Armstrong, P. B. Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro. Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).
- Armstrong, P. B. Motility of the Limulus blood cell. J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).
- Armstrong, P. B. Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces. J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).
- Armstrong, P. B., Cohen, W. D. Blood Cells of Marine Invertebrates. Lab. Animal. , 253-258 (1985).
- Smith, S. A., Berkson, J. Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus). Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).
- Leibovitz, L., Lewbart, G. A., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. The American Horseshoe Crab. , 245-275 (2003).
- Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits. Palaeontology. 51, 1-9 (2008).
- Shuster, C. N., Sekiguchi, K., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. . The American Horseshoe Crab. , 103-132 (2003).
- Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study. Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 .
- Patten, W. The Evolution of the Vertebrates and Their Kin. P. Blakiston’s Son and Co. , 195-209 (1912).
