Overview
资料来源： 实验室的博士伊恩胡椒和博士查尔斯称-亚利桑那大学
演示作者： 布拉德利施密茨和路易莎 Ikner
表层土壤是的拼在一起就形成二次聚合的无机和有机颗粒均匀的混合物。内和骨料之间的空隙或视觉上包含两个的毛孔空气和水。这些条件创建一个理想的生态系统为细菌，所以所有土壤都包含了数量庞大的细菌，通常超过 100 万每克土壤。
细菌是最简单的微生物，称为原核生物。在原核该组内有丝状微生物称为放线菌。放线菌是实际上的细菌，但他们经常被认为是一个独特的群体内的细菌分类由于其丝状的结构，组成的多个单元格，向窗体菌丝串在一起。本实验使用甘油案例媒体选择为放线菌的殖民地，在稀释和电镀。通常情况下，放线菌的细菌总人口的大约 10%。细菌和放线菌发现在每个环境中在地球上，但这些微生物在土壤中的多样性和丰富是无与伦比。这些微生物，对人类生活和什么人吃、 喝、 呼吸，或触摸的影响至关重要。此外，还有细菌物种可以感染人并导致疾病，还有细菌能产生能治病的天然产品。放线菌是产生抗生素，如链霉素的尤为重要。细菌是养分循环、 植物生长和有机污染物的降解的关键。
细菌是物种的高度多样化可以找到在土壤中，部分因为他们生理和代谢功能多样数目。细菌可以是异养，意思他们利用有机的化合物，如葡萄糖、 食品和能源，或自养，意思他们利用无机化合物，如元素硫，对食品和能源。它们也可以是有氧，利用氧气呼吸，或厌氧，利用相结合形式的氧气，如硝酸或硫酸，能够自由呼吸。某些细菌可以使用氧气或组合形式的氧和被称为兼性厌氧菌。
Principles
枚举的存在土壤样品中的细菌数的一种方法是利用稀释和电镀的方法。这种方法利用琼脂作为一种媒介，细菌生长过程被称为"可培养技术"。由于细菌在土壤内发现大量，一个小样本的土壤是串行稀释水，被镀上琼脂平皿内。通常情况下，少量在 0.1 到 1 毫升的稀释的土壤悬液内所载的土壤是"遍布"琼脂板的表面。板包含琼脂，是熔融时热，但固体时很酷。除了琼脂，营养成分，如蛋白胨酵母或 R2A，作为商业上可用的产品添加到介质，以便异养细菌的生长。
稀释和电镀是廉价和相对简单的技术，计数的土壤细菌。然而，有几个缺点的技术。一些常见的错误和与稀释和电镀检测相关的假设如下： 它假定每个单一的土壤细菌引起的殖民地，但在现实生活中的殖民地可能出现从一丛细胞，导致真正的可培养计数的低估。在连续稀释法的土壤，土壤颗粒可以安顿出 （秋天到底部），所以真正分装的土壤不传递到下一个稀释。许多土壤中的微生物是可行，但非可培养。缓慢增长细菌不可能在可见殖民地在合理的时间内 （1-2 周）。
而且在此基础上，厌氧细菌不会在有氧条件下，加入到中的营养物质所选择做生长的细菌。因此 R2A 选择异养细菌，而单质硫自养硫氧化剂的选择。总体来看，估计只有 0.1 到 1%的所有土壤细菌可进行培养。因此，稀释和电镀的土壤细菌只占可培养细菌和低估真实可行的土壤人口由一到两个数量级。造成土壤稀释和电镀的异养细菌菌落的示例如图 1所示。请注意，大约 100 万的细菌细胞都需要一个殖民地，肉眼可见。
本实验演示的稀释和扩散电镀方法用于枚举内土壤样品的细菌的数量。具体而言，使用两个媒体： 一个用于所有的细菌，和其他选择的放线菌。一旦细菌菌落已经在琼脂板上，通过使用一种条纹板技术隔离选定殖民地的纯培养。这种纯培养然后可以进一步分析和具体特征和功能的特点。
图 1。R2琼脂平板上的异养殖民地。从土壤稀释和镀后产生的一些离散殖民地与多样形态。使用由学术出版社授予的权限。
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Procedure
1.土壤稀释液的制备
- 开始执行程序，称出 10 克的土壤样本，并将添加到 95 mL 的去离子水。摇匀，暂停和"A"的标签。
- 土壤落定之前，删除 1 mL 悬浮液与不育吸管和移交 9 mL 去离子的水的空白。涡彻底，和作为"B"的标签。
- 重复此稀释步骤三次，每次 1 毫升的前悬架和 9 毫升与去离子水空白。标签这些顺序作为管 C、 D 和 e。这将导致 10-1 10-5克每毫升土壤通过系列稀释
2.制作传播细菌培养板
- 生长菌落，他们为 C、 D 和 E.涡样本 C、 D 和 E 和吸管 0.1 毫升装每个盘子里拿三个预先准备好的蛋白胨酵母琼脂板，标签。这增加了十倍稀释值进一步，(C = 10-3，D = 10-4，E = 10-5)。
- 接下来，将玻璃吊具蘸乙醇。将摊铺机放在火焰的几秒钟，点燃并烧掉乙醇。这将消毒吊具。
- 按住上面第一板吊具，直到熄灭的火焰。打开板快，持有由合上的盖子。触摸到从接种琼脂吊具 (接种 = 细胞用于开始文化) 冷却，和然后传播滴接种在琼脂表面附近，直到游离液体的痕迹消失。更换板盖。
- 重新火焰吊具和重复此过程下, 一板，迅速工作，以免弄脏与机载有机体琼脂
- 细菌板在室温下孵育 1 周。请确保板孵化，防止水分从堕琼脂表面结露滴期间被倒置。
3.使扩散板的放线菌
- 成长放线菌，把事先准备好的甘油-酪蛋白三个盘子，并贴上标签为 B，C，和 D.采用前面所示的技术扩散板 0.1 毫升从悬浮物 B、 C 和 d。低稀释使用因为放线菌是通常存在作为细菌群体的 1/10th (B = 10-2，C = 10-3，D = 10-4)。
- 孵育放线菌板 （倒） 在室温下为 2 周。
4.细菌和放线菌计数
- 经过孵化，所有细菌板仔细检查，并注意在蚁群的规模和形状的差异。当在琼脂上生长，细菌能产生粘糊糊的殖民地，从无色到明亮的橙色、 黄色或粉红色。相比之下，放线菌菌落垩白、 坚定，革质，并将打破在压力下，在那里其他细菌菌落将涂片。这允许殖民地通过触摸与不育的循环变化加以区别。
- 点算并记录的细菌菌落，包括任何放线菌数量。只能算 30-200 殖民地每板板。
5.纯文化的隔离
- 从任何板块选择单个菌落。如果土壤特别感兴趣，可以选择更多的殖民地。使用高稀释板，因为它往往会有很好分离的纯殖民地。选择从邻近的殖民地是分离良好和看形态有别于彼此的殖民地。
- 通过浸在酒精和燃烧了消毒循环。快速打开培养皿的兴趣，并触摸到光秃的斑点，在琼脂培养基中使它冷却回路。然后，删除少量的殖民地上的循环利息。
- 以新鲜的蛋白胨酵母板，使条纹几厘米长的一边。消毒和晾凉再一次，然后使仅在第一遍十字架的初始连胜的条纹。重复此过程以同样的方式两次更多。这个裸奔的"稀释"结果回路分开另一个单元格中。将盘子放在黑暗的地方，在室温下孵育两个星期。
确定环境细菌准确计数是土壤生态系统健康评价的关键。这可以通过培养细菌菌落与适当稀释。
土壤细菌是分解、 固氮，和养分循环中扮演着角色的一个健康的土壤生态系统的重要组成部分。表层土壤的承印物上的有机和无机颗粒成型周边毛孔复矩阵，充满空气或水。这些条件与表层土壤通常含有超过 100 万细菌每克创建为细菌，理想的生态系统。
因为这个含有高浓度的细菌，稀释是必要镀上增长媒体前。系列稀释可以降低到足够低，可以为单一的殖民地，在媒体板弯曲，从而使计算的初始计数的土壤样品中的细菌生长的水平原土样浓度。
这个视频将说明如何编写串行稀释度的土壤样品，如何板这些细菌的样品，以及如何计算土壤细菌从稀释平板计数。
细菌是简单的原核生物，但高度多样化的物种和生态系统。放线菌的细菌经常被认为是一个独特的群体，由于他们的丝状结构，在那儿他们种植在一起，形成菌丝紧张的一个子集。
通常情况下，放线菌占土壤细菌人口总数的 10%。细菌和放线菌在地球上，几乎每个环境中丰富但在无可比拟的多样和丰富土壤中的发现。
土壤细菌是枚举，和潜在地培养和鉴定，稀释镀。在这里，土壤样品是连续在水中，稀释，然后分散到琼脂生长板上。然后计算，由此产生的殖民地。此值，以及稀释因子，用来阐明土壤中的细菌的初始浓度。
稀释镀很常见，价格低廉，细菌枚举的简单方法，但它确实患有几个缺点。土壤不应允许在稀释，可能会导致有偏的增长过程中解决。一些土壤细菌不会文化在碟子里，或成长太慢被观察。此外，此方法假定殖民地的形成从一个单一的细菌，但它们可能源自丛生的多个单元格。
某些细菌的种类生长在不同的生长介质上得更好。共同的基板，文化种类繁多的细菌是一种琼脂蛋白胨酵母板。放线菌优先生长在甘油-酪蛋白的基础板，更好地适应这些丝状细菌的生长。
现在，您了解细菌枚举背后的概念，让我们看看这个过程如何进行在实验室里。
开始执行程序，称出 10 克的土壤样本，并将添加到 95 mL 的去离子水。摇匀，暂停和"A"的标签。土壤落定以前，删除 1 mL 无菌吸管与悬浮液并将其转移到 9 毫升的去离子水。涡彻底，和作为"B"的标签。
重复此稀释步骤 3 次，每次 1 毫升的前悬架和 9 毫升的去离子水。标签这些顺序作为管 C、 D 和 e。这个结果在 10-1 10-5克每毫升土壤通过系列稀释。
生长菌落，采取 3 预先准备好的蛋白胨酵母琼脂平板和贴上标签 E.涡、 C 和 D，以及相应的样品和吸管 0.1 毫升装每个盘子里。由于 CFUs 报告每毫升，进一步使用 0.1 毫升增加十倍稀释。
接下来，将玻璃吊具蘸乙醇。将摊铺机放在火焰的几秒钟，点燃并烧掉乙醇。这将消毒吊具。
按住上面第一板吊具，直到熄灭的火焰。打开板快，持有由合上的盖子。触摸到接种来冷却，从琼脂吊具，然后蔓延接种周围表面滴，直到游离液体的痕迹消失。更换板盖。
重新火焰吊具和重复此过程下, 一板，迅速工作，以免弄脏板与机载的有机体。逆变板，可防止水分滴落到琼脂，并在室温下板孵育一周。
成长放线菌，把事先准备好的甘油-酪蛋白三个盘子，并贴上标签为 B，C，和 D.采用前面所示的技术扩散板 0.1 毫升从悬浮物 B、 C 和 d。低稀释使用因为放线菌是通常存在作为 1/10 的细菌类群。
最后，反转这些板块和储存在室温为两周。
经过孵化，所有细菌板仔细检查，并注意在蚁群的规模和形状的差异。当在琼脂上生长，细菌能产生粘糊糊的殖民地，从无色到明亮的橙色、 黄色或粉红色。相比之下，放线菌菌落垩白、 坚定，革质，并将打破在压力下，在那里其他细菌菌落将涂片。这允许殖民地通过触摸与不育的循环变化加以区别。
点算并记录的细菌菌落，包括任何放线菌数量。只能算 30-200 殖民地每板板。
成长文化特定的细菌，从任何板块，选择很好地分开的殖民地从邻近的殖民地选择离散的殖民地。消毒的传播循环，然后打开板和触摸到一个空的点来冷却回路。接下来，选择少量的殖民地上的循环利息。
以新鲜的蛋白胨酵母板，使条纹几厘米长的一边。消毒和晾凉再一次，然后使仅在第一遍十字架的初始连胜的条纹。重复此过程以同样的方式两次更多。这个裸奔的"稀释"结果回路分开另一个单元格中。将盘子放在黑暗的地方，在室温下孵育两个星期。
从细菌和放线菌的菌落数，可以确定菌落形成单位每克土壤。每克土壤的殖民地的数量等于殖民地在盘子里，乘以稀释镀的倒数计数的数量。例如，如果 46 殖民地在 10-5与 0.1 毫升孕育剂稀释平板计数，然后每克土壤 CFU 等于 10-6 46，或每克土壤的 4600 万 CFUs。
演出细菌计数以及文化有很多科学调查或协议的关键第一步。
健康的土壤中含有之间 106和 108细菌每克。土壤的细菌枚举可以用于确定健康的兴趣，土壤和计数小于 106和 108细菌每克表明不健康或差的土壤。这可能会造成缺乏的营养物质或有机物质，由于极端土壤 ph 值或土壤污染的非生物胁迫。
从土壤细菌或真菌首先确定了许多类型的今天在医学上使用的抗生素。分离纯菌株从土文化可以有可能帮助科学家的帮助识别新抗生素化合物。在这里，测试细菌或感兴趣的孤立的化合物可以添加到板随着细菌的草坪，和他们对草坪生长的影响记录。由测试细菌或复合，抑制生长的细菌草坪清晰补丁可能表明抗菌活性。
豆科植物包括豌豆和豆类依靠共生关系与固氮细菌。这些细菌自由自在地生活在土壤中或在根系，结节内，产生被植物利用的氮化合物。在贫瘠的土壤，补充土壤中固氮细菌与豆科作物可能促进经济增长和健康的植物。这可以导致更大、 耐寒的植物，反过来给更多的作物产量。
你刚看了朱庇特的简介细菌的枚举。现在，您应该了解如何执行的土壤样品的稀释、 如何平板菌落计数和菌落分离，以及如何计算土壤样品中细菌的数量。谢谢观赏 ！
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Results
一份 10 g 样品的土壤和水分含量为 20%干体重的基础上分析了通过稀释和电镀技术可行可培养细菌。稀释了如表 1所示。1 毫升的解决方案 E 是倒镀到适当的介质上，结果在 200 细菌菌落。
但是，潮湿的土壤，10g
因此，
| 一步 | 稀释 | |
| 10 g 土 （重量/容量） | 95 毫升生理盐水 （方案 A） | 10-1 |
| 1 毫升溶液 （卷/卷） | 9 毫升生理盐水 （解决方案 B） | 10-2 |
| 1 毫升溶液 B （卷/卷） | 9 毫升生理盐水 （解决方案 C） | 10-3 |
| 1 毫升溶液 C （卷/卷） | 9 毫升生理盐水 （解决方案 D） | 10-4 |
| 1 毫升溶液 D （卷/卷） | 9 毫升生理盐水 （解决方案 E） | 10-5 |
表 1： 稀释和电镀的样品。
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Applications and Summary
有两个基本应用程序的稀释和电镀的土壤细菌。第一个应用程序是可培养细菌内一种特殊土的枚举。定量测定的土壤细菌数量说明土壤健康。例如，如果有 106至 108可培养细菌目前每克土壤，这将被认为健康的数量。A 数少于 106每克指示土壤健康状况差，可能是由于缺乏营养作为发现低有机质土壤;非生物胁迫征收极端土壤 pH 值 (pH < 5 或 > 8);或征收有机或无机的汇的人为污染物的毒性。
第二个主要的应用是可视化和分离的细菌纯培养。随后的纯文化可以特征以及评估可能有用在医学或环境的应用程序中的具体特点。例子包括： 抗生素的生产;生物降解的有毒有机物;或特定根瘤菌固氮作用的豆科作物，例如豌豆或蚕豆有用。
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