Overview
ソース: ジェフ Salacup - マサチューセッツ大学アマースト校講座
有機溶媒抽出、総脂質抽出物 (TLE) の製品が多いが、さまざまな化合物の何千人もいない場合、何百もの複雑な混合物。研究者化合物の一握りに興味がある多くの場合のみまたは、多くでは、興味があるなら「的」が不要な成分を削除する必要があります共同溶出します。たとえば、FID (pA) の応答との化合物 (例えばng/μ L) サンプルの量の関係は線形および敏感なので、サンプルの個々 の化合物の濃度は炎イオン化検出器 (ガスクロマト グラフ) に結合されたガスのクロマト グラフの頻繁決定されます。楽器の GC の部分は、異なる化合物の沸点、化学構造、用途を変更することができる固相との親和性に基づくサンプルを分離します。結果は、時間だけでなく、(曲線下面積として算出) の相対濃度別化学成分の分離を示すクロマト グラム (イチジクure 1) です。ただし、時々 以上 1 つの化合物は、GC オフ時 (図ure 1) た。この場合、サンプルの精製は、化合物を自信を持って示すことができる前に必要です。
図 1.時間との相対濃度 (曲線の下の領域) の異なる化学成分の分離を示すクロマト グラム。共同溶出と分離のピークが表示されます。
Principles
FAMEs (脂肪酸メチルエステル) 地上や海洋微生物の重要な成分である、通常使用されます、遺伝学的手法と組み合わせて現代と古代における生態系の微生物の多様性を記述します。ただし、サンプルの FAMEs の存在は、常に便利ですありません。自分と同様のサイズと化学のため alkenonatescommonly と呼ばれる FAMEs 共同アルケノン (図 2) と呼ばれる、長鎖アルキル ケトンと溶出します。サンプルのアルケノンの分布関連サンプルが取得された時間や場所で海表面温度に関する情報とその正確かつ正確な特性が重要ですので。
鹸化は、脂肪酸、変更アルケノン (図 3) 共同溶出からそれらを削除する彼らの化学的特性を十分に FAMEs を変換する一般的な浄化手法です。Saponificationis 加水分解の形。加水分解で、水の分子が分割されます。鹸化は水酸化カリウム (KOH) などの塩基の存在下で加速が加水分解です。コ K+ 、オハイオ州-水の中に溶解します。名声の中心に少し、正荷電の第三炭素原子に水酸化物イオン (OH-、負荷電のイオン) を追加します (図 3トップ)。しかし、この化学的構成が安定している、(炭素があまりにも多くの他の原子に結合して) アルコキシド (盧-) を追放。基本の共役の H この追放フォーム迅速に移動、アルコキシド アルコール メタノール、脂肪酸カリウム塩 (図 3中間) を形成します。この時点で、問題のある名声 (alkenoate) は、もはやそれを示して共同化学に変換されています。ただし、名声化学分析も 1 つ場合は、彼らでクリアできる酸 (HCl) 溶液に添加 pH に達する ~ 2 まで。この pH で脂肪酸のカリウム塩、カルボン酸とイオン塩 (KCl; を形成する分割します。図 3、下)。
図 2.の化学構造、アルケノン37 炭素原子と2二重結合 (上) とそれに関連付けられました。alkenoate名声 (下部).
図 3.加水分解 (http://www.mpbio.com/) の率を高めるため水酸化カリウム (KOH) を用いたパルミチン酸の鹸化度の概略図。
鹸化は、複雑な有機性混合物からの脂肪酸メチルエステルを削除する一般的に使用される手法です。
複雑な有機物は、ガス ・ クロマトグラフィー、個々 のコンポーネントの相対濃度を決定するために使用によって分析される頻繁。
ただし、サイズと構造が似ている化合物は、楽器、結果が歪曲で区別できません。したがって、重複する信号を生成する不要な化合物は、正確な結果を得るために削除する必要があります。
このビデオは、古のアルケノンを浄化するために鹸化の使用をカバーしています。複雑なバイオ マーカー サンプルの精製を詳述したシリーズの最初のです。それは技術のいくつかの他の用途と同様、プロシージャをカバーします。
アルケノンと呼ばれる、多価不飽和長鎖アルキル ケトンは、過去の海の表面温度に関する有用な情報を提供するために示されています。
ただし、しばしばアルケノンを生成する生物はメチルエステル サイズと alkenoates と呼ばれる、化学構造の類似している脂肪酸を作成します。これらの類似性のため alkenoates は、正確な分析を得ることができる前に取除かれなければなりません。
鹸化はこれらの分子の共同の溶出を防ぐために使用される一般的な手法です。鹸化はエステルの分子結束を分割するために水を利用しています。ベースは、alkenoate の中心部にカーボンにアタッチします。この付加反応は、不安定な中間体を作成し、アルコキシドを追放しました。
追放されたアルコキシドと結果として得られるカルボン酸の陰イオンに新たに形成された酸の動きから水素は、ベースから陽イオンとイオン結合を形成します。結果は、アルコールと脂肪酸塩です。強い酸を追加すると、カルボン酸を再生成します。この時点で、問題のある alkenoate は、もはや共同関心のアルケノンとたフォームに変換されています。
鹸化を使用して有機性混合物を浄化する方法を理解すると、処理を開始する準備が整いました。
まず、乾燥の全脂質エキス - または TLE - 溶媒抽出法を用いて得られたを取得します。次に、テキスト プロトコルで説明したように鹸化ソリューションを準備します。すべてのコンポーネントに純粋で炭化水素の無料を確認します。ソリューションを準備し、60 mL ホウケイ酸ガラス小瓶に乾燥 TLE を追加します。2 通常水酸化カリウム、2 mL を追加し、バイアルをシールします。次に、エステル結合を切断する 2.5 h 60 ° C までバイアルを加熱します。これが完了したら、部屋の温度に冷却するサンプルを許可します。サンプルを冷却した後、バイアルに 5% 塩化ナトリウム溶液 2 mL を追加します。バイアル、キャップ、簡単に振る。Ph 試験紙を使用したテスト - 2 の pH に達するまでに 6 N 塩酸を滴下追加します。この酸の添加がある最終製品の安定したカルボン酸を形成するカルボン酸の陰イオン。
酸性のソリューションは無料のエステル、ヘキサン 5 mL を追加します。キャップし、水から有機物を抽出する 5 秒間積極的に振る。有機までソリューションを許可し、水性相は完全に分離します。塩・ イオン ・未反応の塩酸は、有機化合物がヘキサンに分ける間、水相に残ります。フェーズが完全に分離して、一度、ピペットを使用してヘキサンの約 75% を削除し、別の 40 mL のバイアルに分注します。この抽出プロセス追加 2 回、たびにヘキサン 5 mL を追加するを繰り返します。これが完了したら、適切な廃棄容器に残った水溶液を破棄します。新鮮な鹸化有機相を含むバイアルのラベルを付けます。カルボン酸の生産は、さらに精製することがなくアルケノン分析用機器に注入できません。カルボン酸ガス クロマト グラフにすばやく注入は蓄積され、入口、入口ライナーと列のフロント エンドを台無しに。 、これらのアミノ酸を削除するサンプルが最初別の浄化法を受ける必要: カラム ・ クロマトグラフィによる分離。
鹸化が抽出し、有機分子の精製で複数のアプリケーションです。
鹸化は、バイオ マーカーを分離するだけでなく、商用製品で使用するための個々 のコンポーネントを抽出する使用できます。この例では、タバコの木 -タバコアラカシ- からの化合物が分離・をさまざまな燃料、熱、化学物質の配列などのバイオ製品の原料としての可能性を検討します。
葉が均質化、まず興味の分子を集中する遠心分離します。濃縮された植物材料は、鹸化させた「。ビタミン E 化合物の家族は通常植物に見られる - トコフェ ロールの濃度を決定するための液体クロマトグラフィー-質量分析で抽出された材料を行った。
抽出された素材は再構成された生体外で元の構成も可能です。この例では鹸化は後で再構成された体外するホウレンソウからカロテノイドを抽出に使用されました。ほうれん草は均質化、まず遠心、色素分子を収穫します。これらの分子は、鹸化を開始, 漏斗に水酸化カリウムの溶液に、中断されました。鹸化のカロテノイドは、収集された乾燥エーテル層に分けられます。ソリューション バッファー、カロチノイド - と他の色素分子 - の一連を使用していた後で再構成された体外です。この浄化は構造化の有機化合物同様に干渉することがなくこれらの顔料の分析に使用できます。
エステルを加水分解する能力のためそれ以外の高分子にバインドされている化合物を「無料」鹸化を使用できます。この例では、無水鹸化ステップ エチル 4-fluorobenzoate を potassium4 fluorobenzoate のカルボン酸塩に変換されます。SFB の原油の生産のため鹸化を通じてこの脱保護可能にする-可能な分子が残っただろう反応を「スタック」。
U の浄化へゼウスの導入を見ただけk'鹸化を37サンプル。今鹸化のしくみと総脂質抽出液中のアルケノンを浄化するためにそれを使用する方法を理解する必要があります。それ以上の精製プロセスは、それに続くビデオで実証されます。
見てくれてありがとう!
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Procedure
1. セットアップと材料の準備
- 総脂質抽出物 (TLE) を溶媒抽出法 (超音波、ソックスレー、または加速溶媒抽出 (ASE)) を使用してを取得します。
- 5% H2O メタノール 2 N koh 溶液を調製します。
- 島とメタノールは化学の小売店から購入できます。これらの化学物質は、純粋で炭化水素の自由にする必要があります。
- 島のモル質量は島の各モルのためのオハイオ州-の 1 mol を降伏 〜 56 amu です。したがって、2 N 濃度を達成するために 0.95 L の純粋な水とメタノールの 0.05 L コの 112 g を溶解します。
- 水の島の分解は発熱し、大量の熱に注意してください。暴力的な反応を避けるためにゆっくりと水を KOH ペレットを追加する注意してください。
- 自動攪拌プレート上の純粋な水の 0.95 L KOH ペレットの 112 g 溶解します。
- KOH のすべてが水溶液に有機バイオ マーカーの溶解のため解散した後は、メタノールの 0.05 L を追加します。
- 島とメタノールは化学の小売店から購入できます。これらの化学物質は、純粋で炭化水素の自由にする必要があります。
- 6 N 塩酸 (HCl) H2o. でのソリューションを準備します。
- HCl は、化学の小売店から購入できます。この化学物質が純粋な炭化水素の無料必要があります。
- HCl は、通常 13 (名) として集中はしたがって、HCl と純粋な水の 1:1 の混合物は、この実験のために 6 N に十分近いである HCl の 6.5 N の混合物を生成します。
- 水に、塩酸を追加してください、ない他のやり方、濃塩酸に水を加えて発熱は、熱を生成します。これは、スプラッシュに HCl を引き起こす可能性があります。
- 静かにゆっくりと 100 mL 塩酸 100 mL を含むビーカーに純粋な水、HCl の間に混合物を注ぐ。
- 5% の溶液を調製塩化ナトリウム (食塩) H2o.
- 塩化ナトリウムは、化学の小売店から購入できます。この化学物質が純粋な炭化水素の無料必要があります。
- 計算して 5% 溶液 (w/w) ~ 1 L を作るために必要な塩の質量をはかります。水 1 リットル 〜 1 kg または 1,000 g の重量を量る。したがって、950 mL に溶解した塩化ナトリウム 50 g 50 g + 950 = 1,000 g; 50 g/1,000 g = 0.05 (5%) の 5% 溶液を与えます。
- 優しく自動攪拌プレートに純粋な水に塩化ナトリウム 50 g を追加し、解散を待ちます。
- 次の資料の入手: 2 クリーンと PTFE ライニング キャップ; 燃焼 (6 時間 550 ° C) 40 mL ホウケイ酸ガラス瓶地球温暖化のオーブンか熱するブロック;燃焼 (6 時間 550 ° C) ホウケイ酸ガラス ピペットおよび球根;テープ pH (酸性の範囲);ヘキサン (ヘキサンは化学の小売店から購入できます。この化学物質べきオプティマ グレードまたはそれと同等)。
2. 方法
- (エステルを含む) 乾燥 tle 40 mL ホウケイ酸ガラス瓶のいずれかで開始します。
- TLE とキャップに 2 N 島の約 10 mL を追加します。
- 熱オーブンやエステル結合 (図 3) を切断する 2.5 h の 60 ° C に加熱ブロックを。
- 暑さからサンプルを取り出し、室温に冷却します。
- 5% 塩化ナトリウム溶液約 10 mL を TLE (図 3) に追加します。これは、泡から (追加) に水溶液と有機相界面を保つことができます。キャップと簡単に振る。
- O-にある pH 2 に到達するまで滴下塩漬け TLE に 6 N 塩酸を追加し、最終製品、安定したカルボン酸 (図 3; 使用 ph 試験紙をテストする) を形成します。TLE が着色された場合、pH 2 に合わせ色に変化があるかもしれません。
- 約 20 mL のヘキサンをエステル無料今は酸性のソリューションに追加します。キャップ、積極的に 5 振る s 水から有機物を抽出します。
- 完全に独立した水溶液および有機性段階まで設定できるようにします。塩、イオン、水、および未反応の塩酸は、水相に残ります。有機化合物がヘキサンになります。
- ピペットを使用して培養上清中のヘキサンの約 75% を削除し、他の 40 mL ホウケイ酸塩からすのバイアルに分注します。
- 2.7-2.9 倍、たびに約 10 mL のヘキサンを追加するを繰り返します。
- 適切な廃棄容器に残った水の混合を破棄します。
- 「TLE - 鹸化させた「」ヘキサンとエステル無料有機物を含むバイアルにラベルを付ける
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Results
この浄化は、共同のアルケノンの溶出がありますエステルの無料 TLE を生成します。しかし、浄化は、カルボン酸は、一般的に低揮発性のためアルケノン濃度のサンプルを分析する使用される機器に注入することはできませんを生産しました。たとえば、ヘキサン、6 炭素の炭化水素の沸点は 68 ° C、その酸 (オクチル酸) の沸点が 205 ° C。ほとんど GC 従順なバイオ マーカーは、20 から 35 の炭素原子 (原子数の増加と増加する一般に沸点)、する必要があるし、ほとんどの GC 温度プログラム停止約 300 ° C。すぐに GC に注入されるカルボン酸蓄積し、入口、入口ライナーと列のフロント エンドを台無しに。これらのアミノ酸を削除するには、サンプルは最初別の浄化技術分離カラム ・ クロマトグラフィ経由を受ける必要があります。
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Applications and Summary
前述のように、alkenoates は、共同のガスクロマト グラフ (図ure 1) のアルケノンの溶出と呼ばれるアルケノンの脂肪酸メチルエステル (FAMEs) を削除する、鹸化、有機地球化学のラボで使用されます。鹸化も「無料」脂肪酸「バインド」堆積物や高分子にされます。機能グループ (N, O, S) の除去と高分子に個々 のマーカーの最終的な重合やバイオ マーカーと鉱物表面に高分子の吸着分解と有機物および堆積物中のバイオ マーカーの保存が含まれます。設定になるバインドでないすべてのバイオ マーカーと無料バインドされたバイオ マーカーの比は、設定と堆積物年代理由はまだ完全に説明すれば変更できます。時々 ここで説明よりも高温で鹸化 (> 200 ° C)、それら、彼らのソース、およびバインドされた本来の責任のメカニズムを説明するためにバインドされているマーカーを解放します。
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