מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג’י, אר-אל-ג’י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN
איסוף דם הוא דרישה נפוצה למחקרים הכוללים עכברים וחולדות. שיטת נסיגת הדם בעכברים וחולדות תלויה בנפח הדם הדרוש, בתדירות הדגימה, במצב הבריאותי של החיה שיש לדמם, וברמת המיומנות של הטכנאי. 1 כל השיטות שנדונו- דימומים בסינוס רטרו-מסלולית, דימומים ראשוניים של חיתוך זנב ודימומים תוך-לבביים – דורשות שימוש בהרדמה כללית.
לפני הליך הדימום, יש לקבוע את סוג המדגם הנדרש. הליכים ניסיוניים עשויים לדרוש דם שלם, פלזמה או נסיוב. עבור דם שלם, יש להוסיף נוגד קרישה לדגימה. פלזמה, המכיל פיברינוגן וגורמי קרישה אחרים כאשר מופרדים מתאי הדם האדומים, ניתן לחלץ מדגם נוגד קרישה. סרום מתקבל באמצעות איסוף דם ללא נוגד קרישה. הנסיוב ייווצר מצנטריפוגה של הדגימה ברגע שנוצר קריש דם. כמו המדגם יש קרישה, הסרום לא יכיל פיברינוגן או גורמי קרישה אחרים. הן פלזמה והן סרום מתקבלים באמצעות צנטריפוגה לרוץ ב 2200-2500 סל”ד למשך מינימום של 15 דקות.
עבור מדגם שחייב להניב דם שלם או פלזמה, יש להשתמש נוגד קרישה מתאים. נוגדי קרישה נפוצים עבור חיות מעבדה הם הפרין, נתרן סיטראט, חומצה טטראצטית אתילנדיאמין (EDTA); הבחירה בה מבוססת על צרכי מחקר. ניתן לטעון ישירות למזרק צורה נוזלית של EDTA, הפרין ונתרן סיטראט. זה מאפשר מגע של נוגד קרישה ישירות כמו הדם נמשך, סיוע במניעת קרישה. כמו קרישי דם חולדה מהר יותר מאשר רוב דם היונקים, זה חיוני כי היחס הנכון של נוגד קרישה לדם ישמש לאיסוף דם.
בחירת המחט מבוססת על גודל החיה והאתר של venipuncture. באופן כללי, ככל שהשעמום של המחט גדול יותר, כך ניתן לאסוף את המדגם במהירות רבה יותר. פחות נזק לתאי הדם הוא יתרון נוסף למחטים גדולות יותר. עם זאת, החיסרון העיקרי למחטים גדולות הוא הנזק הפוטנציאלי לכלי הדם. על עכברים וחולדות, הבחירות של גודל נע בין 20-29 מחטים מד כי הם 0.5-1.5 אינץ ‘אורך. אם מחט ארוכה מדי, לא רק שזה מביך לשימוש, אבל יש את המרחב הנוסף במחט יכול לגרום קרישה. גודל המחט המתאים מופיע עבור כל שיטה בסעיף ההליכים.
יש גם תגדיר מראש את גודל המדגם הנדרש. בשל הגודל הקטן של העכבר או החולדה, יש לחשב את הכמות המרבית של איסוף דם עבור דימום הישרדותי. עכבר ממוצע במשקל 25 גרם יש נפח דם כולל של 1.8 מ”ל; החולדה הממוצעת במשקל 250 גרם יש נפח דם כולל של 16 מ”ל. עבור דגימת דם אחת על עכבר או חולדה ללא החלפת נוזלים, נפח הדם המרבי שניתן להסיר בבטחה הוא 10% מנפח הדם הכולל, או 7.7-8 מיקרול/גרם. לכן עבור עכבר ממוצע, 10% מנפח הדם שלה הוא 193-200 μl. עבור חולדה ממוצעת של 250 גרם, זה שווה ערך 1.9-2.0 מ”ל. מחקרים הראו כי הסרת יותר מ -15% מנפח הדם יכולה לגרום להלם תת-נפחי. 1,2 עם זאת, עם החלפת נוזלים, עד 15% מכלל נפח הדם – או 12 μl / g-ניתן להסיר. עבור עכבר 25 גרם, זה שווה ערך 300 μl; עבור חולדה 250 גרם, זה שווה ערך 3 מ”ל. להחלפת נוזלים, יש לחמם את הנוזלים ולהעניק אותם באופן תת עורי.
אם יש צורך לקחת דגימות מרובות, נפח הדם נמשך מופחת. נפח הדם המרבי שניתן לצייר בשבוע הוא לא יותר מ 7.5% מכלל נפח הדם, או 6 μl/ g. עבור עכבר 25 גרם, זה שווה ערך 145-150 μl בשבוע. עבור חולדה 250 גרם, זה שווה ערך 1.45-1.50 מ”ל בשבוע. אם דגימה תתרחש כל שבועיים, עד 10% מנפח הדם הכולל (8 מיקרול/גרם) עשוי להימשך. זה שווה ערך 200 μl כל שבועיים עבור עכבר ממוצע, ועד 2.00 מ”ל כל 2 שבועות עבור חולדה 250 גרם. מחקר אחד, שבוצע על חולדות עם משקל ממוצע של 250 גרם, גילה כי כאשר נפחי דם של 15-20% הוסרו, זה לקח יותר מ 29 ימים עבור רמות הדם לנרמל. 1,2 לאיסוף דם חוזר ונשנית, החלפת נוזלים אינה מאפשרת נפח דם גדול יותר או איסוף דם תכוף יותר, שכן הוא מחליף רק נפח. החיה תזדקק לזמן כדי לחדש את מלאי תאי הדם.
השימוש בקלעת הרטרו-מסלולית היה מנהג נפוץ בעבר. עם זאת, חששות רבים לגבי האנושיות של הליך זה התעוררו. במהלך ההליך, תנועה מופרזת של צינור המטוקריט פעם להציב קנתוס המתיווך של העין יכול לגרום נזק לרקמות שמסביב, וכתוצאה מכך נפיחות של העפעפיים ו /או ממברנות הלחמית. הרקמות הנפוחות יכולות לגרום לגלגל העין לבלוט מספיק רחוק, כך שסגירת העפעף תיפגע, מה שעלול לגרום לייבוש ונזק בקרנית. כאב מנפיחות יכול לעורר גירוד והשחתה עצמית שתוצאתה תמריץ את העין. מיקום לא תקין של צינור המטוקריט במהלך דימום רטרו-מסלולי יכול לנתק את עצב הראייה, וכתוצאה מכך עיוורון. אם צינור ההמטוקריט מתקדם בזווית לא נכונה, ניתן לכפות את העין לצאת מהמסלול, מה שמאפשר לעפעפיים ליפול מאחורי גלגל העין. אם זה קורה, קשה מאוד להחליף את העין כראוי לתוך השקע. בעיות אחרות שעלולות להתעורר כוללות שבירה של עצמות המסלול השברירי, חדירה של כדור הארץ וכתוצאה מכך אובדן הומור זגג, או היווצרות של שטף דם מאחורי העין שיכול לגרום לכאב קיצוני עקב הלחץ על העין והמבנים שמסביב. למרות כל החששות הללו, אם טכנאי מיומן מבצע את ההליך והחיה מורדם לחלוטין עם הרדמה כללית, כגון הרדמה משאיפה איזופלורן, דימום רטרו-מסלולי הוכח כשיטה יעילה של איסוף דם במכרסמים.
המבנה האנטומי של אזור המסלול שונה בין העכבר לעכברוש. לעכבר יש את הסינוס הרטרו-מסלולי – אוסף של כלי שיט שיוצרים סינוס באזור המסלול. במסלול של עין החולדה, יש מקלעת של כלי שיט שזורמים מאחורי העין; עם זאת, הם אינם יוצרים סינוס, כמו בעכבר. כתוצאה מכך, קל יותר לבצע הליך זה על עכברים. עבור איסוף דגימה חוזר דרך מקלעת רטרו-מסלולית, מינימום של 10 ימים בין דימומים נדרש כדי לאפשר את הרקמות באזור לרפא. למרות הרדמה כללית מומלץ, ההליך יכול להתבצע בעכברים ללא הרדמה כללית אם הרדמה עיניים אקטואלי, כגון פרופרקאין או טטרקאין, מוחל לפני ההליך. מכיוון שלעכברושים אין את הסינוס הרטרו-מסלולי, ומכיוון שהממברנות שלהם סביב המסלול חזקות בהרבה, חובה להרידים אותן להליך זה.
ניתן להשיג דוגמאות טוריות של אמצעי אחסון קטן באמצעות שיטת קליפ זנב. הקטיעה הראשונית של הזנב חייבת להיות מוגבלת לקצה הזנב, כ 0.5-1.0 מ”מ אורך בעכברים ו 2.0 מ”מ בחולדות. 1 הליך חיתוך הזנב לאיסוף דם מאפשר איסוף סדרתי על ידי שיבוש הגלד או קריש של החתך המקורי בסוף הזנב. בדרך כלל, קטיעה נוספת של קצה הזנב אינה הכרחית. נפחי הדם שנאספו נעים בין 20-100 μL לעכברים ו 75-150 μL עבור חולדות. הסכום שנאסף משתנה בין בעלי חיים ויכול להיות מושפע מגיל, מצב בריאותי ומשקל.
המדגם שנאסף מגזרת זנב יכול להכיל דם עורקי ורידי, יחד עם זיהום מוצר רקמה. איכות המדגם פוחתת אם הזנב הוא ליטף או “חלב” כדי להשיג יותר דם. כדי להגביר את זרימת הדם, הזנב יכול להיות מחומם עם קומפרסים חמים, מנורת חום, או שקוע במים חמים. לחץ צריך להיות מופעל על קצה הזנב עבור hemostasis, ובעלי חיים צריך להיבדק כל 5-10 דקות כדי להבטיח hemostasis הושג. המוסטזיס מתעכב לעתים קרובות עם דגימה חוזרת ונשנית. אבקה סטייפטית עשויה לשמש להמוסטזיס. עבור הקטיעה הראשונית, מומלץ הרדמה (כללית או מקומית). דימום לאחר מכן לא צריך לדרוש הרדמה, במיוחד כמו בעלי החיים להיות רגילים להליך. הרדמה תגרום לירידה בלחץ הדם, מה שהופך את איסוף הדם עם טכניקה זו קשה.
חלופה לגזור זנב היא ניק כלי הזנב. הליך זה מבוצע בקלות הן על עכברים והן על חולדות. עם זאת, כמו עם חיתוך הזנב, הדגימות עשויות להיות מזוהמות עם מוצרי רקמות, במיוחד בעכבר. עבור חולדות, מחט תת עורית מוכנסת לכלי, והדם נאסף ממרכז המחט. מחקר אחד הדגים את השימוש ב חוסם עורקים שהוצב מעל אתר ניקוב המחט כדי לסייע באיסוף דם. 3 מזרק אינו משמש כדי להוציא את הדם מהכלי, שכן הלחץ שנוצר מהמזרק ימוטט את כלי הדם. שיטה זו יכולה לשמש גם לדגימה טורית, כמו קריש ניתן להסיר כדי לגרום לאתר לדמם שוב. כמו עם חיתולים זנב, זה הכרחי כדי להבטיח hemostasis על ידי הפעלת לחץ על האתר ובדיקה מחדש של החיה כל 5-10 דקות.
לעתים קרובות, מחקרים דורשים דגימת דם לא-שורבית וגדולה שנאספה באמצעות דימום תוך-לבבי או קווה הווריד. 4 כמחצית נפח הדם הכולל ניתן לאסוף מעכבר או חולדה על ידי ניקוב לב. זה שווה ערך 40 μl/g או כ 1 מיליליטר עבור עכבר ממוצע 25 גרם. חולדה 250 גרם תיבול כ 10 מ”ל של דם. החיה חייבת להיות מרדים לדם. הרדמה תפופה או CO 2 נרקוסיס יכול לשמש על ידיטכנאי מיומן; ניתן להשתמש גם בהרדמה להזרקה. עם זאת, ייתכן שיש ירידה בלחץ הדם ובמחזור הדם, אשר יכול להפחית את כמות הדם שנאסף.
שיטת הווצק הקאווה caudal דורשת כי החיה להיות מרדים עמוק לחשוף את הכלי בניתוח. CO2 נרקוסיס אינו מספיק, כמו הלב חייב להיות פועם ואת הנשימה החיה במהלך גמילה מהדם. במהלך ההליך, מהיר מדי של נסיגת דם יכול לגרום לכלי לקרוס על שיפוע המזרק, אוסם את הפתח ומניעת איסוף דם. כמו כן, קירות כלי הדם דקים, ולכן יש להימנע מתנועה של היד והמחט כדי למנוע קרע או דליפת דם מאתר הכניסה למחט. כמו המחט אינה עוברת דרך העור, שיטה זו גורמת לאיסוף של מדגם סטרילי. יש להשתמש בשיטות המתת חסד כדי להבטיח שבעל החיים לא יתאושש מהרדמה. שיטה זו מלווה לעתים קרובות זלוף לב או בתחום העורקים.
השיטה תוך-לבבית יכולה להתבצע עם בעל החיים מרוסן באופן ידני ברגע שהוא מרדים (שיטה סגורה), או הלב יכול להיחשף בניתוח לפי הפרוטוקול עבור שיטת איסוף דם veaudal veva (שיטה פתוחה). עבור השיטה הסגורה, ציוני הדרך למיקום מחט הם החריץ שנוצר על ידי כלוב הצלעות בתהליך xiphoid, בצד שמאל של החיה.
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
