Overview
资料来源：阿尔文·苏普里阿特纳1号、凯尔西·布林斯2号、克雷格·戈尔根1号
1韦尔登生物医学工程学院，普渡大学，拉斐特，印第安纳州
2普渡大学生物化学系，拉斐特，印第安纳州
近红外荧光 （NIRF） 成像是一种令人兴奋的光学技术，它利用荧光探针来可视化组织中的复杂生物分子组件。与传统的非侵入性成像方法相比，NIRF成像具有许多优点。与单光子发射计算机断层扫描 （SPECT） 和正电子发射断层扫描 （PET） 不同，NIRF 成像是快速、高通量的，并且不涉及电离辐射。此外，工程靶特和可激活荧光探针的最新发展为NIRF提供了高特异性和灵敏度，使其成为研究癌症和心血管疾病的一种有吸引力的方式。提出的程序旨在演示NIRF成像背后的原理，以及如何在小型动物体内进行体内和体外实验，以研究各种疾病。此处显示的特定示例采用基质金属蛋白酶-2 （MMP2） 的可激活荧光探针，以研究其在腹部主动脉瘤 （AAA） 的两种不同啮齿动物模型中的接受率。
Principles
顾名思义，NIRF 成像利用第一个近红外窗口内光，范围从 650 nm 到 900 nm，将光子送入组织。光子的能量，E，以方程1为特征，其中h是普朗克的常数，c是真空中的光速，α是光的波长。
* 
（公式 1）
目标特异性荧光分子称为荧光道，通常通过基因工程或通过在成像前通过尾静脉注射引入动物。这些荧光量道吸收光子能量，将分子的能量从地面状态S0提高到不稳定的兴奋状态S1。由于S1状态的不稳定性，分子在那种状态内放松到最低的振动能量水平，以热的形式释放能量。荧光道，现在在放松，兴奋状态S1，然后返回到地面状态S0，以特定波长发光。由于热量以热的形式消散，发射的光波长较长，然后使用荧光成像系统捕获和记录。吸收和发射光谱之间的根本偏移称为斯托克斯移位，这很重要，因为它能够区分激发光和发射光。
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Procedure
以下过程提供了从小动物体内和体外收集 NIRF 图像所需的详细步骤：
1.实验设置
- 使用光纤导光导轨将光纤光源连接到荧光成像系统。
- 为实验选择适当的激励过滤器。激励滤波器确定要传送到样品的光的波长，并应选择与样品中引入的荧光激发光谱相匹配。
- 选择适当的排放过滤器。发射滤波器阻挡不需要的光谱成分，这些成分可归因于自荧光，应选择与荧光的发射光谱相匹配。
2. 样品制备
-
在维沃
- 在感应室中使用异二苯在流量计表盘上浓度为3-4%的异二苯酶对动物进行麻醉。
- 将动物转移到固定在成像阶段的鼻锥体上，并将异二苯的浓度保持在1-2%。热源是没有必要的，因为动物通常只被成像很短的时间（> 5分钟），并且他们的体温不会显著下降。
- 固定动物的爪子，以尽量减少运动伪影。应用脱毛霜，从感兴趣的区域去除头发。
- 将脱脂霜涂抹到所需的最小区域。30 s 后，用纱布垫擦拭。第二次用乙醇润湿纱布垫擦拭区域，以完全去除脱毛霜。
- 在眼睛上涂上眼膏，防止角膜干燥。
- 将可激活的荧光分子探针注射到动物中。对于这一特定应用，MMP2可激活探针静脉注射到尾静脉。此时，可以对鼠标进行成像。继续执行此协议的"图像获取"。在整个简短过程中，监测动物有规律的呼吸。
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埃克维沃
- 注射荧光探针后，根据2013年AVMA动物安乐死指南，以人道的方式对动物实施安乐死。二氧化碳 （CO2） 过量是小动物安乐死的标准做法.
- 手术提取感兴趣的组织或器官，并小心地用钳子去除多余的脂肪组织。
- 用磷酸盐缓冲盐水冲洗组织，去除残留血液，并将样品直接放在成像阶段。
3. 图像采集
- 打开分子成像软件，同时打开光纤光源和荧光成像系统。
- 打开采集窗口并指定适合研究的曝光类型。可用曝光包括：用于捕获单个图像的标准曝光、在固定时间间隔内捕获一系列图像的时移曝光，以及用于在不同曝光时间捕获连续曝光序列的"渐进式曝光"。
- 选择UV-透射作为照明源。
- 使用预览图像作为参考，调整镜头、视野和捕捉系统室中的光圈/光圈的焦点，以优化采样图像质量。调整样品的曝光时间和位置。
- 关闭预览窗口，并确保采集窗口上的所有参数与相机和滤镜设置匹配。
- 单击"公开"以获取并保存图像。
- 标准分子成像软件通常提供各种分析、测量和图像校正工具，用于量化荧光信号，用于图像分析。
- 在成像会话结束时，取出样品/动物，关闭系统，并清洁成像阶段，以尽量减少对系统的损坏。
近红外荧光成像是一种利用荧光探针来可视化组织中复杂生物分子组件的光学技术。这种非侵入性成像技术，也称为NIRF，速度快，不需要电离辐射。
在NIRF中，荧光探针可与小分子结合，提高特异性，研究癌症和心血管疾病的进展。它们被穿透深入组织的近红外光所激发，可用于从改变这些目标分子浓度的病变组织中划定健康组织。
本视频将说明近红外荧光成像背后的原理，以及如何在小型动物中进行体内和体外实验，以研究各种疾病。
顾名思义，近红外荧光成像利用第一个近红外窗口内的光线，范围从650纳米到900纳米，将光子送入组织。目标特异性荧光分子称为荧光道，通常在成像前通过基因工程或注射引入动物。
这些荧光素吸收光子能量，将分子的能量从地面状态S0提高到不稳定的兴奋状态S1素数。由于这种状态是不稳定的，分子会放松到激发状态内的最低振动能量水平，以热的形式释放能量。荧光道，现在处于放松兴奋状态的S1，然后返回到地面状态，发出特定波长的光。
由于当分子松弛到最低振动能量水平时，以热的形式消散的能量，这种光的波长比最初引入荧光的光要长。然后，使用荧光成像系统捕获和记录发射的光。
荧光素的吸收和发射光谱图显示了荧光光能分别吸收和发射的波长范围。这种根本变化，即峰值吸收和峰值发射波长之间的纳米差，称为斯托克斯移位。每个荧光具有独特的斯托克斯偏移，使发射光与刺激光区别开来，使NIRF等成像技术成为可能。
在回顾了近红外荧光成像的主要原理后，现在让我们演练一下准备和成像动物的分步过程。
首先，使用光纤光导将光纤光源连接到荧光成像系统。选择与样品中引入荧光的激发光谱相匹配的激励滤波器，以确保提供正确的光波长。
接下来，选择适当的发射滤波器以匹配荧光的发射光谱，该辐射光谱将阻挡可能归因于自荧光的不需要的光谱成分。
为了开始准备体内成像，使用异物对动物进行麻醉。将动物转移到固定在成像阶段的鼻锥体。固定动物的爪子，以尽量减少运动伪影。涂抹脱毛霜，将头发从感兴趣区域去除。然后，在动物的眼睛上涂上眼膏，防止角膜干燥。
在此之后，将可激活的荧光分子探针注射到动物中。要开始图像采集，打开分子成像软件。同时打开光纤光源和荧光成像系统。
接下来，打开采集窗口并指定适合研究的曝光类型。可用曝光包括用于捕获单个图像的标准曝光、在固定时间间隔内捕获一系列图像的时差曝光，以及逐步曝光以在不同曝光时间捕获连续曝光序列。
然后，选择 UV 透射作为照明源。以预览图像为参考，调整捕获系统室中的对焦、视场和 F 站，以优化采样图像质量。根据需要调整样品的曝光时间和位置。在此之后，关闭预览窗口。确保采集窗口上的所有参数与摄像机和滤镜设置匹配。单击"公开"以获取并保存图像。
为了准备前体成像，在注射荧光探针后，以人道的方式对动物实施安乐死。使用钳子，小心去除任何多余的围周脂肪。接下来，手术提取感兴趣的组织或器官。用磷酸盐缓冲盐水冲洗组织，去除残留血液。然后，将样品直接放在成像阶段。
图像前体组织遵循与在体内成像描述相同的协议。完成后，从舞台中删除示例。关闭系统并清洁成像阶段。
现在，我们已经完成了获取近红外现场图像的协议，让我们来查看这些扫描的结果。
在这些代表性图像中，通过尾静脉系统注入可激活的荧光探针，以可视化基质金属蛋白酶或 MMP2。在这里，我们看到一个体内NIRF图像的脂蛋白-E缺乏小鼠，在注射血管紧张素II后发展出腹部主动脉瘤。虽然大多数小高信号点来自皮肤自荧光，但血管在视觉上表现为具有高荧光信号的管状结构。
第二个代表性图像比较了来自两个不同动物模型的腹部主动脉瘤的NIRF图像。一，一个下腹主动脉瘤在血管紧张素II注入的脂蛋白-E缺乏小鼠。第二，一只注入猪胰腺乳汁酶的大鼠的肾上腺主动脉瘤。
在每一个，我们看到在腹部主动脉瘤区域的MMP2活性增加。多余的荧光探针被过滤和积累在肾脏中，解释在那里观察到的明亮的荧光信号。
现在让我们来看看近红外场成像的其他一些应用。首先，NIRF成像可用于研究鼠模型中的心血管疾病。
在这项研究中，敲除小鼠被注射两种不同的近红外荧光探针。主数在 24 小时后采集，并通过 NIRF 成像进行评估。结果表明，NIRF反应显著，表明存在与巨噬菌体积累共着的粗钙化。
NIRF成像也可用于定位和评估体内肿瘤。在这项研究中，建立了模拟含有荧光肿瘤模拟内含物的乳房幻象的组织。然后模拟NIRF成像在乳房保护手术中的应用。
结果表明，NIRF可检测到肿瘤状内含物，深度约为2厘米。切口进入覆盖的幻象组织后，可检测到比这更深的内含物。去除内含物后，外科医生评估NIRF图像。任何剩余的荧光，表示肿瘤的存在，表示不完全去除，然后被切除。
您刚刚观看了 JoVE 关于近红外成像的介绍。您现在应该了解荧光激发和发射原理，如何准备动物进行体内和外体NIRF成像，以及一些生物医学应用。感谢您的收看！
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Results
从患有腹部主动脉瘤（AAA）的啮齿动物拍摄的体内和体外NIRF图像如图1-2所示。通过尾静脉系统注入一个可激活的荧光探针，以可视化基质金属蛋白酶-2（MMP2）活性。MMP2 是一种弹性溶酶，参与细胞外基质的降解，在 AAA 的启动和进展中起着重要作用。所有图像均使用 625 nm 激励滤波器、700 nm 发射滤镜和 60 秒曝光时间采集。
图1：一种在体内的NIRF代表图像，该小鼠在注射血管紧张素-II后，研制出AAA。大多数显示高信号的小斑点来自皮肤自荧光（黄色箭头）。血管可以可视化为具有高荧光信号（红色箭头）的管状结构。刻度栏：1 厘米。
图2显示腹部主动脉瘤区域MMP2活性增加，从观察到的信号强度相对于腹部主动脉健康区域的增加可见一斑。此结果与显示 AAA 内 MMP2 水平升高的文献中的结果一致。多余的荧光探针被过滤和积累在肾脏中，导致明亮的荧光信号。
图2：来自两种不同动物模型的AAA的NIRF图像：（A）血管紧张素II-注入脂蛋白-E缺乏小鼠的超量AAA和（B）注入猪胰腺乳酸酶的大鼠的肾上腺AAA。黄色箭头指向 AAA。刻度线：3 毫米。
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Applications and Summary
NIRF 成像依靠荧光探针对组织中的生物分子组件进行量化和可视化。近红外光吸收的光子能量将荧光分子激发到更高的能量状态，荧光成像系统捕获具有较长特征波长的发射光。在这里，NIRF成像对腹部主动脉瘤MMP2活性的研究在体内和体外进行了演示。与SPECT或PET不同，它被认为是研究人体非侵入性代谢过程的黄金标准，NIRF成像是一种快速、高通量的成像技术，不涉及电离辐射。这种模式的局限性之一是渗透深度相对较小。虽然这一局限性使深层组织的临床成像具有挑战性，但NIRF成像在研究小动物肿瘤和心血管疾病方面起着重要的作用。
给定适当的荧光探针，许多分子结构可以使用呈现的NIRF成像程序进行可视化，以研究小动物模型中的疾病启动和进展。特定的体外和体内应用包括：1） 评估啮齿动物血管中的 MMP 活性，2） 不同类型的癌症的早期肿瘤检测，以及 3） 对纳米粒子药代动力学和治疗应用的生物分布的评估。除了AAA内增加的MMP2活性外，其他MMP荧光探针还被用于研究动脉粥样硬化进展和心肌梗死后心脏细胞外基质组合特征。此外，氟磷进青青用于研究后肢缺血的小鼠模型中的组织灌注。为了详细说明NIRF成像在早期癌症检测中的应用，肿瘤靶向NIRF染料可用于评估肿瘤边缘并协助切除程序。近红外荧光荧光道与纳米粒子的整合，用于药物输送，使科学家能够开发出更有效的纳米粒子治疗各种疾病。最后，与其他传统的酶测定（凝胶酶学）和蛋白质分析（西方斑点）相比，在整个动物或完整组织中对荧光信号进行空间本地化的能力具有明显优势，这些分析要求动物被牺牲，组织要同质化。
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