Encyclopedia of Experiments: Biology
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Transcript
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- Comece adicionando E3 de médio a baixo ponto de fusão agarose e aquecendo até que a agarose se dissolva completamente. Esfrie a agarose a 37 graus Celsius e adicione solução de tricaine. Em seguida, anestesiar os embriões adicionando tricaine a uma placa de Petri contendo embriões em meio E3. Gire a placa de Petri para coletar os embriões no meio.
Usando uma pipeta de transferência, elave um embrião com uma quantidade mínima de meio. Segure a pipeta em uma posição vertical e salte o embrião para posicioná-la na ponta da pipeta. Agora coloque o embrião na solução agarose sem adicionar qualquer meio de excesso, o que diluiria a agarose e impeça a gelagem.
Coloque a placa sob um microscópio e use uma ponta de pipeta para posicionar o embrião na orientação desejada. Uma vez que a agarose solidifique, despeje o meio E3 contendo tricaine em cima dela para manter o ágar hidratado e a imagem do embrião. Em um protocolo de exemplo, montaremos embriões de zebrafish parabióticos para imagem e análise.
Para adquirir imagens dos embriões fundidos, prepare-se 0,8% de baixo ponto de fusão agarose. Enquanto ainda quente, aliquot um mililitro da agarose em tubos de microfuge de 1,5 mililitro situados em um bloco de aquecimento de 37 graus Celsius. Anestesiar os embriões parabióticos adicionando 1 mililitro de 4 miligramas por mililitro pH 7,0 tricaine aos 25 mililitros de E3 médio contendo os embriões.
Em seguida, usando uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga, elaria os embriões o mínimo de líquido possível. Em seguida, vire a pipeta e recorra suavemente os embriões para que se acomodem na parte inferior da pipeta. Em seguida, transfira os embriões para uma alíquota de 1 mililitro de ponto de fusão baixo agarose tocando levemente a ponta pipeta na superfície da agarose. Descarte qualquer excesso de líquido da pipeta e use a pipeta para misturar suavemente os embriões na agarose.
Em seguida, com a pipeta, transfira a agarose e os embriões para o poço de uma placa de seis poços de fundo de vidro. Sob um microscópio estéreo, use uma ponta de carregamento de gel fixada no final de uma agulha de provocação para posicionar os embriões perto do vidro de cobertura e na orientação desejada para a imagem. Depois que a agarose tiver definido e médio com tricaine foi adicionado aos poços, use um confocalismo de epifluorescência de campo largo invertido para adquirir imagens.
Para todo um campo de visão embrionário, use um 4x subjetivo. Use um objetivo de 20x para visualizar um tecido específico. Processe as imagens de acordo com o protocolo de texto.
