마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

이 절차의 전반적인 목표는 분리된 온전한 마우스 망막에서 트랜스 망막 전기망막 기록을 수행하여 막대 및 원뿔 기반 사진 반응을 얻는 것입니다. 먼저 유리 모세혈관과 관류 챔버가 녹음을 위해 준비됩니다. 어두운 적응 마우스의 두 눈 컵은 반구 효과입니다.

적외선 조명과 각막 렌즈와 유리체가 제거됩니다. 망막은 색소 상피에서 벗겨져 여과지 광수용체 쪽에 배치됩니다. Up. 여과지의 망막은 현미경 스테이지의 관류 챔버로 전달되고 차동 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 두 전극 사이에 배치됩니다.

마지막으로, 간상체 및 원뿔 매개 사진 반응은 편평하게 장착된 마우스 망막에서 기록됩니다. 고전적인 단일 세포 기록과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 판막 유형 및 유전자 변형 마우스의 간상 및 콘 지방 수용체에서 약물에 액세스할 수 있는 장기 기록을 가능하게 한다는 것입니다. 희소하고 깨지기 쉬운 마우스에서 안정적이고 더 뚱뚱한 반응을 얻는 데 특히 유용해지고 있습니다.

단점: 유리 모세혈관을 준비하는 것으로 시작합니다. 뜨거운 물에 1.2%한천 10ml를 만드십시오. 한천이 빠르게 응고되는 플라스틱 주사기를 사용하여 유리 모세관에 한천 용액을 채웁니다.

다이아몬드 나이프를 사용하여 모세 혈관을 반으로 자릅니다. 생성된 유리 전극을 섭씨 4도에서 최소 24시간 동안 마우스 전극 용액에 담그십시오. 이제 기계 및 전자기 노이즈를 최소화하기 위해 일반적으로 현미경을 준비하십시오.

진동 방지 테이블에 현미경을 장착하고 패러데이 케이지 내에서 차폐합니다. 그러나 이러한 기능이 필수적인 것은 아닙니다. 망막의 평면에 배치된 광도계를 사용하여 광원을 보정합니다.

LED 광원의 경우 광학 확산기를 사용하여 플라스틱 튜브와 유리 모세관을 사용하여 광의 균일성을 달성합니다. 하부 전극과 전극 홀더를 연결하십시오. 그런 다음 관류 챔버의 하부 전극 공간을 전극 용액으로 채웁니다.

전극, 연결 튜브 또는 전극 홀더에 기포가 없는지 확인하십시오. 주사기로 용액을 제거하여 기포를 제거합니다. 기록 챔버를 현미경 아래에 놓은 후 하부 전극 홀더를 차동 증폭기의 양극 헤드 스테이지 극에 연결합니다.

그런 다음 챔버의 하부 전극 개구부를 자극 광점 거품, 95% 산소, 5% 이산화탄소로 중탄산염 완충 관류 용액을 중앙에 정렬하고 섭씨 40도의 수조에서 배양합니다. 용액 pH는 7.2가 됩니다. 관류 라인을 녹음 챔버에 연결하고 관류를 켭니다.

용액은 중력에 의해 병에서 기록 챔버로 흐릅니다. 세라믹 저항을 통과시켜 섭씨 36도 또는 37도로 재가열합니다. 열 손실을 줄이려면 히터를 녹음실에 최대한 가깝게 위치시켜야 합니다.

이상적으로는 현미경의 스테이지에서 용액 경로에 유량 조절기를 설정하고 분당 약 1밀리리터로 조정합니다. 이제 O-링을 사용하여 전극 홀더를 사용하여 상부 전극을 헤드 스테이지의 두 번째 음극에 연결하고 열전대 프로브를 팁에 최대한 가깝게 이 전극에 바인딩하여 온도 판독값이 망막 중앙 근처에서 이루어지도록 합니다. 다음으로, 상부 전극의 끝을 관류 용액에 담그고 챔버 중앙에 놓습니다.

기준선 안정화를 위해 10-15분 정도 기다립니다. 마지막으로 용액의 온도가 섭씨 36도에서 37도가 되도록 히터의 DC 전압을 조정합니다. 어둡게 마우스를 준비하고 밤새 적응하십시오.

막대 구동 트랜스 망막 녹음을 위해 C 57 black six와 같은 야생형 마우스 또는 원뿔 트랜스 망막 녹음을 위한 막대 신호가 없는 막대 전달 알파 녹아웃 마우스를 사용하십시오.어둠 속에서 작업하기 전에 중앙에 2-2.5mm 구멍을 만들고 모서리에 기름칠을 하여 정사각형 여과지 조각을 준비합니다. 다음 단계는 모두 적외선에서 수행해야 합니다. 해부 현미경에는 반구 섹터 안구의 적외선 이미지 변환기가 장착되어 있습니다.

각막과 수정체를 모두 제거합니다. 이 과정에서 가능한 한 많은 유리체를 제거하십시오. 한 번에 하나의 아이컵으로 작업하여 진행하십시오.

두 번째 아이컵은 순수한 산소와 실온으로 포화된 라이트 타입의 상자에 담긴 배양 용액 접시에 몇 시간 동안 저장하여 전체 망막에서 기록할 수 있습니다. 색소 상피층에서 첫 번째 망막을 벗겨내고 필요한 경우 집게로 철저히 청소하여 색소 상피의 남은 과립을 제거합니다. 망막의 등쪽 부위에서 기록하려면 면도날이나 마이크로 가위를 사용하여 망막을 벗기기 전에 안대컵의 복부 부분을 제거합니다.

그리고 corry 마커 참조를 사용하여 복부 눈 컵을 제거합니다. 피펫을 사용하여 분리된 망막을 페트리 접시 뚜껑에 있는 관류 용액 한 방울로 옮깁니다. 그런 다음 염화바륨이 포함된 전극 용액을 5-6방울 떨어뜨립니다.

집게를 사용하여 망막과 함께 관류 용액 한 방울에 구멍이 있는 준비된 필터를 놓습니다. 광수용체 면이 위로 향하게 하여 여과지 위에 망막을 놓습니다. 그런 다음 주변의 가장자리를 눌러 평평하게 장착합니다.

망막은 여과지의 개구부 중앙에 있어야 합니다. 이제 망막이 있는 여과지를 관류 챔버로 옮기고 자극 지점이 정렬된 하부 전극 공간 위에 놓습니다. 여과지의 그리스 가장자리를 살짝 눌러 챔버와 접착합니다.

마지막으로, 상부 전극을 망막 중앙 위에 올려 전극이 광수용체층에 약간 닿도록 합니다. 이제 트랜스 망막 녹음을 하는 실험을 진행해 보세요. 분석을 위해 우리는 썩은 분자 장치의 피크 램프 10 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 사용합니다.

우리는 긴 녹음 세션 동안 이 LED 소스의 505나노미터 LED 조명을 사용하여 만들었습니다. 광 반응의 신경교 성분의 효율적인 억제를 유지하기 위해 하부 전극 용액이 변경됩니다. 검사 전에 각 망막으로 충분해야 합니다.

LED 광원의 플래시 강도는 LED 전압 전환 가능 저항기의 컴퓨터 제어와 LED와 망막 사이에 배치된 중성 밀도 필터 세트의 조합에 의해 제어되었습니다. LED 테스트 플래시의 지속 시간은 일반적으로 20밀리초이며 컴퓨터에 의해 제어되었습니다. 이러한 C 57 black six mouse rod driven trans retinal recordings는 희미한 광 강도에서 평균 5-6개의 반응과 포화 광 강도에서 2-3개의 반응을 나타내는 흔적을 보여줍니다.

막대 transducing alpha knockout 마우스의 이 원뿔 구동 트랜스 망막 레코딩 데이터의 각 추적은 희미한 광 강도에서 평균 5-10개의 반응을 나타내고 포화 광 강도에서 3-5개의 반응을 나타냅니다. 따라서 이 비디오를 본 후에는 수행 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 여덟, 고립된 쥐 망막에서 전기그램 코팅을 하여 부패 및 사기에 의한 사진 반응을 얻습니다.