Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Dynamik von Ribonukleoprotein-Granula in Primärzellen zu untersuchen, insbesondere die Bildung von Stress-Granula. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen wie Maus, Embryonal, Fibroblasten oder Hippocampus-Neuronen von Tieren von Interesse kultiviert werden. In einem zweiten Schritt wird eine getaggte Komponente des Stressgranulats transfiziert, um deren Visualisierung zu ermöglichen.

Anschließend werden die Zellen stressinduziert und mit einer konfokalen Zeitraffermikroskopie überwacht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Dynamik von G drei BP eins mit Stresskörnern in Mythen oder Spiegel- und Hippocampus-Neuronen auf der Grundlage ihrer direkten Visualisierung. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Stressreaktion in Zellen wie Neuronen zu beantworten.

Zum Beispiel wurden bei Mäusen neuronale Defekte gefunden, der den Knockdown von RNA und dem Verbot von Proteinen entspricht, die für Stressgranula essentiell sind. Diese Methode kann also helfen, die Mechanismen hinter diesen Beobachtungen zu verstehen. Nach dem Einschläfern einer E 13,5 trächtigen Maus die Maus mit 90%igem Ethanol desinfizieren und die Gebärmutterhörner unter einer sterilen Haube entfernen.

Übertragen Sie die Hörner auf 37 Grad Celsius DPBS und entfernen Sie die Embryonen. Übertragen Sie die Embryonen in eine 100-Millimeter-Schale. Entfernen Sie die überschüssigen Tücher und waschen Sie sie mit warmem DPBS ab.

Entfernen Sie nun unter einem Mikroskop die Gliedmaßen, die inneren Organe und den oberen Teil des Kopfes, in dem sich das Gehirn befindet. Für die Genotypisierung kann das Schwanz- oder Kopfteil verwendet werden. Das restliche Taschentuch in einer separaten Schüssel mindestens eine Minute lang hacken.

Kombinieren Sie keine Genotypen, wenn diese innerhalb des Wurfes variieren sollten. Bedecken Sie das Hackfleisch mit einem x Trypsin EDTA und inkubieren Sie es 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter vollständiges mes-Medium hinzu.

Um die In-Reaktion zu stoppen, lockern Sie das Gewebe mit einer Pipette auf und überführen Sie die resultierende Suspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie die Tube mit Medium auf und lassen Sie den Inhalt absetzen. Dann dekantieren Sie die suspendierten Zellen.

Als nächstes drehen Sie die Federung fünf Minuten lang bei 300 G herunter. Bei Raumtemperatur reus, suspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern vollständigem Medium pro Embryo. Die Anzahl lebensfähiger kernhaltiger Zellen sollte etwa 5 Millionen pro Embryo betragen.

Laden Sie dann 60-Millimeter-Platten mit drei Millilitern Zellsuspension und Kultur. Sie. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium und lassen Sie die Zellen bis zur Konfluenz wachsen. Wenn die Zellen subkultiviert werden, überleben nur Fibroblasten.

Teilen Sie die konfluenten Platten in 35 Millimeter Glas. Untere Gerichte. Bauen Sie diese Gerichte auf einen Alkoholgehalt von 50 bis 70 % an und fahren Sie mit der Transfektion fort.

Für jede 35-Millimeter-Schale sind drei Mikrogramm gereinigtes Plasmid für die Transfektion zu verwenden. Die Verwendung eines im Handel erhältlichen Transfektionskits reicht aus. In diesem Beispiel ein Vektor, der die Lücke der RAs ausdrückt.

Das SSH-Bindungsprotein mit drei Domänen wird transfiziert. Es ist ein wichtiger Bestandteil von Stressgranulaten. Das Verfahren ist natürlich anwendbar auf die Untersuchung eines beliebigen Vektors von Interesse in Fibroblasten am Tag vor der Entnahme des Jungen.

Bereiten Sie die mit Paulin-Lysin überzogenen Gerichte zu, indem Sie zunächst Embryonen von 18,5 DPC-Muttertieren sammeln und sie in einer großen Schüssel an HBSS übertragen. Falls gewünscht, können neugeborene Welpen ersetzt werden, um die Opferung der Mutter zu verhindern. Schneide den Kopf ab und entferne das Gehirn.

Ernten Sie dann das Gehirn des Welpen mit HBSS unter einem Mikroskop in eine saubere Schüssel. Entfernen Sie alle Hirnhäute mit einer feinen Pinzette. Trennen Sie dann die gewünschten Teile des Gehirns, wie z. B. die Nilpferd-Campi.

Übertragen Sie das Gewebe in 4,5 Milliliter kaltes HPSS in 15-Milliliter-Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf. Verdauen Sie das Gewebe, indem Sie 0,5 Milliliter 2,5% ige Trypsinlösung hinzufügen. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten.

Spülen Sie dann das Trypsin mit drei Wäschen HBSS aus und achten Sie darauf, kein Gewebe zu verlieren. Nun resuspendieren Sie das Gewebe in einem halben bis einem Milliliter DMM mit 10%FBS. Homogenisieren Sie dann das Gewebe, indem Sie es durch die Pipette fließen.

Wechseln Sie dann zu einer 200-Mikroliter-Spitze und pipettieren Sie die Lösung, bis keine sichtbaren Aggregate mehr vorhanden sind. Geben Sie anschließend 100 bis 200 Mikroliter der Zellsuspension in 35 Millimeter Glas. Bodenschalen, die mit DMM FBS-Medien zubereitet werden, inkubieren die Schalen. Ersetzen Sie nach drei Stunden Kultivierung das Medium für die verbleibende Kulturzeit durch ein vorwarmes Neuron Complete Media.

Nach fünf bis 14 Tagen in Kultur übertragen Sie die Neuronen mit der Calciumphosphat-Methode. 24 Stunden nach einer erfolgreichen Transfektions-Stress-Granula beginnen sich aufgrund der Überexpression von G drei BP zusammenzusetzen. Zusätzlicher Stress induziert die Montage des Stressgranulats weiter, die konfokalen Mikroskopkomponenten werden mindestens 20 Minuten lang vorgewärmt, einschließlich des Erwärmens des Tisches auf 37 Grad Celsius.

Kurz vor der Visualisierung der Zellen wird ein 35 Millimeter großer Plattenhalter benötigt. Gehen Sie folgendermaßen vor. Ersetzen Sie zunächst alle Zellmedien, die Phenolrot enthalten, durch ein Zellmedium ohne Phenolrot.

Beginnen Sie sofort mit der Bildgebung der Zellen. Stresskörner bilden sich in weniger als einer Stunde, so dass Stress nach der Visualisierung der Zellen induziert wird. Es ist wichtig, die Akquisitionen so schnell wie möglich nach der Induktion von Stress zu beginnen und zwei Parameter je nach Zelltyp und Proteintyp genau einzustellen.

Die Laserintensität und die Dauer der Erfassungen sind niedriger als beide, um die Zytotoxizität zu reduzieren. Betrachten Sie als Nächstes die Zellen mit einem 40 x und 63 x Ölimmersionsobjektiv. Achten Sie darauf, dass die Platte flach in der Halterung sitzt und verwenden Sie das Leuchtstofflicht minimal.

Sobald ein Interessenfeld lokalisiert ist, verwenden Sie die Software, um Bilder aufzunehmen. Beginnen Sie mit einer Laserleistung von 10 % oder weniger und stellen Sie die Verstärkung und den Offset ein, um das bestmögliche Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Scannen Sie bei 1000 Hertz, um die Exposition der Zellen gegenüber dem lasereingestellten Krankheitsstapel wie gewünscht zu minimieren, und halten Sie das Scanintervall so lang wie möglich, um die Gesundheit der Kultur besser zu erhalten.

Erfassen Sie Daten so lange wie nötig in MEFs Granulate bilden sich innerhalb von 10 Minuten und sind innerhalb einer Stunde deutlich sichtbar. In Neuronen verläuft der Prozess etwas langsamer. G drei BP sollte unter Verwendung der beschriebenen Techniken mindestens 45 Minuten lang ein einigermaßen starkes Signal liefern.

Die Bildung von Stressgranula wurde in kultivierten Zellen überwacht. Die Lokalisation des G-drei-BP-markierten Proteins war in den im Zytoplasma kultivierten Mythen diffus und auch im Zytoplasma von Neuronen diffus. Bei der Behandlung mit Arsonit lokalisieren sich die Proteine eindeutig in definierten und größeren Herden in beiden Zelltypen.

Das sind die Stressgranulate. Die aufgenommenen Bilder können zu einem Zeitrafferfilm rekonstruiert werden. Das erste und zweite Video zeigen Fibroblasten, die auf Stress reagieren.

Das dritte Video zeigt dasselbe. In einem Hippocampus-Neuron bieten Zack-Rekonstruktionen eine 3D-Lokalisierung des getaggten G drei B bp und damit eine andere Perspektive auf das Tracking. Nach diesem Verfahren kann die Immun-Zyto-Chemie verwendet werden, um die Granulatkomponenten nach verschiedenen Arten von Stress und nach Selbstfixierung zu visualisieren.

Dies kann quantitative Fragen über die Größe und die Anzahl der verschiedenen Zellkörper unter verschiedenen Bedingungen beantworten.