Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la formation de filaments bactériens dans un dispositif microfluidique comportant des micro-piliers. Cela est réalisé en premier lieu par la fabrication de la puce microfluidique. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver les bactéries testées, dans ce cas Pseudomonas fluorescens.

Les étapes finales consistent à assembler le dispositif expérimental, à injecter les bactéries dans la puce microfluidique et à recueillir les données. En fin de compte, les résultats peuvent montrer l'évolution temporelle des filamentations à l'aide d'images de microscopie par fluorescence. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les différentes étapes sont difficiles à apprendre.

En raison de la nature interdisciplinaire de l'expérience, cette procédure nécessite des tranches de silicium munies de gravure ionique réactive profonde. Le photo-résist sur les tranches doit être éliminé. Commencez par le moule principal silencieux.

Ajoutez deux ou trois gouttes de trichloroéthylène dans un flacon et placez-le dans un dessiccateur, en laissant le moule en position orientée vers le haut à côté. En deux ou trois heures, le moule sera silanisé. Pendant la silanisation, préparez le mélange de PDMS en mélangeant la base de silicone Cigar 1 8 4 avec un agent de réticulation selon un rapport de 10 à 1.

Ensuite, dégazer le PDMS sous vide pendant environ deux heures. Transférer maintenant une plaquette silanisée vers un support et verser le PDMS dessus, en veillant à ce qu'aucune bulle ne se forme. Laisser le PDMS polymériser sur la plaquette à 80 degrés Celsius pendant deux heures.

Ceci permet de fabriquer un tampon A-P-D-M-S à partir du moule en silicium dimensionné. Une fois le durcissement terminé, détacher délicatement le tampon PDMS à l’aide d’un cutter. Ensuite, découper le tampon pour former une puce microfluidique à l’aide du cutter.

À présent, utilisez un foret carottier pour percer des trous aux positions d'entrée et de sortie sur le tampon. L'étape suivante consiste à coller le tampon sur du verre. Exposez une lame de couverture de 24 millimètres et le tampon en PDMS à un plasma d'oxygène pendant 30 secondes.

Après l'exposition, fixer la lame couvre-objet sur le côté inférieur du tampon en PDMS afin qu'un collage se forme. Placer l'ensemble dans un four à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour terminer le processus de ce protocole, préparer des boîtes de milieu LB fabriquées avec de l'eau ultrapure et additionnées de 50 microgrammes par millilitre de tétracycline ajoutée à une température de 50 à 55 degrés Celsius.

Lors de la coulée des boîtes, les bulles peuvent être éliminées en les passant brièvement à la flamme. Les boîtes refroidies et solidifiées doivent être datées et conservées à quatre degrés Celsius, enveloppées dans du papier d’aluminium. Préparez également du bouillon LB à l’eau ultra-pure, additionné de 50 microgrammes par millilitre de tétracycline.

Conserver le bouillon à quatre degrés Celsius et également enveloppé dans du papier d'aluminium. Maintenant, cultiver des stocks de Pseudomonas fluorescens conservés à moins 80 degrés Celsius sur des géloses LB ; tracer les géloses selon un motif en zigzag et les incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Le lendemain, prélever une colonie sur la gélose et ensemencer un flacon contenant un milieu S1 fraîchement préparé, incubé toute la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation à 150 tr/min.

Mesurez la densité optique de la culture après l'incubation. Préparez ensuite la solution S deux. Ajoutez cinq millilitres de LB dans un tube en plastique, puis ajoutez suffisamment de la solution S un pour obtenir une DO à 600 nanomètres de 0,1, ce qui est typique pour une expérience de biofilm.

Commencez par installer l'expérience à l'aide de pincettes. Reliez des tubes en plastique d'un diamètre intérieur de 0,20 pouce aux entrées et sorties de la puce préparée. Les tubes doivent être flexibles et suffisamment longs. Ici, ils mesurent environ 20 pouces.

Ensuite, remplir les seringues avec la solution S2. Fixer des aiguilles émoussées de calibre 30 et éliminer les bulles. Il est essentiel d'empêcher l'entrée de bulles d'air dans le canal, en particulier en raison de la durée prolongée de l'expérience.

Les bulles peuvent endommager les structures fragiles formées par les bactéries. Ensuite, connectez les seringues aux tubes d'entrée et reliez les tubes de sortie à des récipients pour déchets. Placez maintenant les seringues dans une pompe à seringue et réglez la pompe à la vitesse d'écoulement souhaitée, par exemple huit microlitres par heure, sur un microscope équipé d'une chambre à cellules maintenue à la température d'incubation.

Utilisez un objectif 40 x pour observer la puce microfluidique. Démarrez maintenant la pompe. Lorsque les bactéries sont introduites dans la chambre, la formation du biofilm commence également.

Le biofilm va se former et mûrir pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours ; prenez des images pour suivre son évolution. Une puce microfluidique fabriquée par SEMA a été utilisée pour l'imagerie. L'entrée en forme de fourche est créée afin d'égaliser la pression hydraulique sur l'ensemble du dispositif.

On peut également observer que les parois des piliers sont presque verticales. Pour examiner la formation de biofilm, des fluorophores ont été injectés dans le dispositif à un débit de huit microlitres par heure. La formation du biofilm a commencé quelques minutes après l'infusion de la culture bactérienne diluée.

Cependant, après quelques heures, l'apparition de structures filamenteuses s'étendant entre les micro-piliers a été observée près de la région médiane. L'ellipse en pointillés délimite un flux en formation ; les flux se formaient fixés par une extrémité à la région polaire de l'un des micro-piliers. Des flux ont également été observés le long de la diagonale entre deux micro-piliers.

L'épaisseur des filaments augmentait au fil du temps en raison de la division cellulaire ainsi que de l'incorporation de bactéries planctoniques. Ils proliféraient également au fil du temps, et l'occupation d'un volume important dans le dispositif menait à la formation d'un biofilm mature, pouvant entraîner un colmatage du dispositif. Une simulation mécanique de l'écoulement à travers le dispositif montre que les filaments s'orientent initialement le long des lignes de courant du fluide.

De plus, lors de la phase initiale, les filaments se forment à des endroits où la vitesse d'écoulement est maximale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment les filaments de biofilm se forment et évoluent dans un environnement microfluidique. N'oubliez pas que manipuler des bactéries peut présenter un danger extrême, et que des précautions telles que le respect des protocoles de biosécurité doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.