Protocoles pour l'obtention Zygotic et embryons somatiques pour l'étude de la réglementation de développement précoce de l'embryon dans la légumineuse modèle

L'objectif général des procédures suivantes est de montrer combien d'embryons de cargo tula peuvent être obtenus à différents stades de développement afin d'étudier la régulation génétique de l'embryogenèse chez les plantes. Ceci peut être réalisé en associant la morphologie des gousses aux différents stades de développement de l'embryon zygotique, ainsi qu'en cultivant des explants foliaires pour obtenir des embryons somatiques aux différents stades. En fin de compte, la PCR quantitative et la bêta-glucuronidase peuvent être utilisées pour évaluer l'expression des gènes durant l'embryogenèse aux stades de développement spécifiques d'intérêt. Les avantages de ces techniques sont qu'aucun marquage individuel des fleurs n'est requis pour les expériences in vivo, et que les protocoles in vitro optimisés offrent des approches expérimentales complémentaires.

La démonstration visuelle de la procédure de culture est importante car elle permet de suivre plus précisément les détails des manipulations. La procédure in vivo sera réalisée par ing Wang, tandis que Kim Nolan démontrera la procédure in vitro. Pour faciliter le développement de l'embryon zygotique, percer la surface des testas des graines provenant d'une plante trinoculaire Monte cargo et faire tremper les graines toute la nuit, entièrement recouvertes d'eau.

Le lendemain, semer trois graines dans chacun des 10 pots de 15 centimètres de diamètre contenant un mélange de terreau et transférer les pots dans une serre. Faire pousser les plantes sous une photopériode de 14 heures avec une température diurne de 23 à 19 degrés Celsius la nuit, conserver les semis les plus vigoureux après la germination afin d'obtenir une seule plante par pot, et entourer les semis d'un treillis sur lequel les tiges pourront grimper lorsque les gousses apparaîtront. Récolter aux stades appropriés décrits dans le tableau un et la figure un afin d'obtenir le stade souhaité de développement précoce de l'embryon.

Ensuite, utilisez une pince pour isoler les embryons des gousses. Alternativement, pour une microscopie plus fine, clarifiez complètement dans la solution de Hoyer ; les stades des embryons peuvent alors être confirmés par imagerie au microscope composé standard. Puis récoltez le nombre d'UL requis pour l'expérience à partir de la région centrale de la gousse et conservez-les à la température appropriée en vue d'une analyse ultérieure du développement des embryons somatiques.

Récolter in vitro les folioles du dernier feuillet presque complètement développé d'une tige en allongement d'un cultivar de tran atula capable de former facilement des embryons en culture. Conserver les feuilles sur un essuie-tout humide dans un pot de culture afin d'éviter la déshydratation. Puis, travailler dans une hotte de sécurité biologique stérilisée aux UV et placer les feuilles dans la boule en treillis d'un infuseur à thé à ressort stérilisé au moyen d'un autoclave.

Un diffuseur immergé dans de l'éthanol à 70 % dans un flacon stérilisable de 250 millilitres à bouchon vissé. Après 30 secondes, égoutter le tissu foliaire, puis immerger le diffuseur dans une solution d'eau de Javel diluée au 1/8 pendant 10 minutes. En agitant doucement de temps à autre, faire tourner délicatement le récipient et éliminer l'excès d'eau.

Ensuite, rincez l'infuseur. Une fois de plus, dans de l'eau déionisée fraîche, dans une nouvelle casserole. Utilisez maintenant des pinces stériles pour transférer les feuilles de l'infuseur vers une nouvelle culture, dans un pot d'eau distillée déionisée stérile, puis vissez le bouchon stérile.

Ensuite, rincez les feuilles par inversion et agitation. Puis laissez les folioles flotter sur l'eau stérile pour ensemencer les implants. Taillez les bords des folioles individuelles stérilisées en utilisant une technique stérile.

Ensuite, découper le rectangle restant en deux ou trois explants rectangulaires de huit à dix sur trois à cinq millimètres, avec la nervure médiane au centre de chaque explant X. Six explants X par milieu de culture solidifié à l'agar dans des boîtes de Pétri de neuf centimètres de diamètre, avec le côté scellé ABA vers le bas afin de maintenir l'orientation habituelle de la feuille.

Ensuite, sceller les boîtes de Pétri avec du perfil et incuber les boîtes au noir à 28 degrés Celsius dans une pièce à température contrôlée. Après trois semaines, utiliser une spatule et une pince en acier inoxydable stériles pour subcultiver les explants de trou différenciant sur un milieu frais. Les premiers embryons doivent être observés environ quatre semaines plus tard, lorsque le bourgeonnement se produit et que le cal devient plus grand que la taille du plus grand explant montré ici.

Transférez uniquement 50 % du calse individuel lors du passage en sous-culture dans un milieu frais. Enfin, utilisez un microscope stéréo pour collecter les différents stades embryonnaires au cours d'une période d'incubation de quatre à huit semaines, en traitant les explants selon les objectifs expérimentaux. Après la récolte des embryons zygotiques comme vient de l'être démontré, des stratégies en aval telles que l'analyse C deux hybride ou d'autres approches appropriées peuvent être employées ; particulièrement intéressante, comme illustré sur ces images, la distinction entre SSIS et Spencer peut être observée en suivant les X plans en culture.

Entre les semaines quatre et huit, des embryons somatiques à des stades précis peuvent être localisés et prélevés pour une analyse immédiate. Par exemple, ces données illustrent comment les embryons au stade précoce Olein expriment un type de gène medicago Tula eoin, mais pas un autre. Un avantage particulier du système d'embryons somatiques est que la transformation du calse peut être réalisée sans régénérer une plante entière.

En effet, comme le montre cette démonstration. La bêta-glucuronidase peut être utilisée pour visualiser l'expression génique aux différents stades de l'embryogenèse. Après avoir visionné la vidéo, vous devriez bien comprendre comment sélectionner et disséquer les gousses afin d'obtenir des embryons.

Vous devriez également bien comprendre comment préparer et ensemencer de façon stérile des explants pour l'embryogenèse somatique après leur développement. Ces techniques ont permis d'étudier la régulation transcriptionnelle des stades précoces de l'embryogenèse en lien avec le développement de la croissance de l'embryon et le stockage des nutriments.