Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'effetto dell'alcol sugli organi CL di diversi genotipi in modo coerente. Ciò si ottiene creando prima una piastra di agar contenente alcol con anelli di rame incorporati nella superficie per recintare gli animali. Successivamente, i diversi genotipi vengono racchiusi separatamente ed esposti all'alcol Durante l'esposizione, i dati video vengono raccolti in punti temporali prestabiliti.

La fase finale è la misurazione della velocità di ciascun genotipo utilizzando un software di riconoscimento degli oggetti. In definitiva, viene utilizzato un confronto delle velocità nei primi e nei tardi punti temporali per scoprire lo sviluppo anomalo di sensibilità o tolleranza all'alcol. I genotipi specifici.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che confrontano i genotipi in piastre diverse, è che la variazione ambientale è ridotta. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a raccogliere i vermi usando un plettro nudo il giorno prima del test. Prelevare i vermi a quattro stadi L per le piastre NGM fresche Seduto con un prato di coltura OP 50 E coli, le piastre a 20 gradi Celsius durante la notte, il test richiede uno standard non posizionato 60 per 15 millimetri.

Le piastre NGM asciugano tutte le piastre da utilizzare a 37 gradi Celsius per due ore senza coperchio. Ogni prova richiede quattro piastre. L'uso di piastre NGM è importante in questo caso.

Differenze nella composizione delle piastre. In particolare, la loro osmolarità può influenzare fortemente il comportamento dell'etanolo sensibile alla dose. Ciò è dovuto, almeno in parte, alle variazioni della quantità di etanolo accumulata dagli animali. Una volta essiccati, pesare ciascuna delle piastre NGM non posizionate.

Utilizzare questo peso per determinare il volume del supporto su ciascuna piastra, supponendo che il supporto pesi quanto l'acqua. Successivamente, pianifica di fondere quattro anelli di rame con un diametro interno di 1,6 centimetri in ciascuna piastra, in modo che possano essere visualizzati dalla fotocamera contemporaneamente. Usando il forcipe.

Mangia ogni anello a fiamma per circa tre secondi e metti subito l'anello sul piatto senza farlo cadere. Quindi premere delicatamente l'anello in alcuni punti per fissarlo lungo la periferia. Etichettare le piastre con la deformazione che sarà in ogni anello.

Ora, calcola la quantità di etanolo al 100% necessaria per ottenere una concentrazione di 400 millimolari di peso in volume sulla piastra. Quindi caricare metà delle piastre con etanolo spruzzando l'etanolo da una pipetta. Lasciate equilibrare tutte le piastre preparate per due ore prima di iniziare l'esperimento.

Per iniziare, prenditi due minuti o meno per trasferire 10 vermi da ciascun gruppo sperimentale al centro di un anello di rame su una piastra di acclimatazione. Questa è una piastra senza etanolo. Evita di trasferire il cibo con i vermi in quanto ridurrà il loro movimento.

Inoltre, evita di danneggiare la superficie dell'agar perché i vermi scavano. Registrare il tempo di caricamento sulla lastra e assicurarsi di scaglionare il trasferimento dei vermi su ciascuna lastra di oltre due minuti, in modo che ogni lastra possa essere filmata individualmente all'intervallo di tempo appropriato. Lasciare incubare ogni piastra di acclimatazione a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi trasferire i vermi sulla piastra di analisi seguendo l'ordine utilizzato per posizionare i vermi sulla piastra di acclimatazione utilizzando un verme appiattito dai bordi sottili. Raccogli senza batteri. Raccogli i vermi sopra il piccone appiattito.

Utilizzando un movimento a cucchiaio, sigillare le piastre con una pellicola da laboratorio per ridurre al minimo la perdita di etanolo durante la vaporizzazione. La velocità con cui gli animali vengono trasferiti in questa fase è molto importante perché il trasferimento agli animali sarà esposto all'etanolo più a lungo, quindi è una buona idea ruotare i ceppi posizionati sulla piastra. Prima attraverso le repliche sperimentali.

Per filmare i vermi è necessario un microscopio con videocamera ad alta risoluzione. Ora, anche l'illuminazione, ad esempio da una retroilluminazione quadrata da tre pollici, è vitale per l'analisi. Quindi, per mantenere l'immagine di contrasto con il supporto della lastra rivolto verso l'alto, preparare il software di analisi delle immagini per acquisire 120.

Inquadra filmati time-lapse in scala di grigi a 12 bit in un fotogramma al secondo. Per ridurre le dimensioni del file di output pur mantenendo una risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzare una modalità di piegatura due a due. A questo punto, registrare filmati di due minuti da ciascuna piastra.

10 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati messi su quel piatto. Quindi effettuare una seconda registrazione di due minuti. 30 minuti dopo che i vermi sono stati posizionati sulla piastra per questa immagine dimostrativa.

Viene utilizzato il software Pro plus, ma un'ampia varietà di altri software può essere adattata alla tecnica. Analizza i filmati come segmenti di due minuti. Innanzitutto, applica un filtro alle immagini che appiattisce lo sfondo e migliora il contrasto degli oggetti vermi.

Nel menu seleziona il processo. Quindi filtra, quindi migliora e infine appiattisci. Imposta il parametro per uno sfondo scuro e una larghezza della funzione di 20 prelunte.

Ora analizza la locomozione degli animali in ogni anello separatamente con una regione circolare di interesse che si sovrappone all'anello di rame. Identifica e traccia i vermi con il comando traccia oggetti nel sottomenu misura. Nella finestra della tabella dei dati di rilevamento, utilizzare il pulsante delle opzioni di rilevamento per consentire l'esclusione di tracce specifiche e limitare eventuali artefatti sperimentali.

Nella scheda Tracciamento automatico, impostate i parametri della traccia su un limite di velocità di 400 micron per fotogramma. Impostare il limite di accelerazione su automatico, impostare la lunghezza minima totale della pista su 400 micron e impostare il tipo di movimento predominante su caotico. Quindi, sotto il parametro track, impostare gli oggetti in modo che le tracce parziali abbiano una lunghezza minima di 21 fotogrammi e una profondità di previsione del tracciamento di un fotogramma.

Ora per avviare prima il processo di tracciamento, fare clic sul pulsante funzione Trova tutte le tracce automaticamente. Vengono visualizzate la finestra di dialogo delle opzioni di conteggio delle dimensioni e la finestra di dialogo del tracciamento. Selezionare l'opzione manuale per la selezione dell'intervallo di intensità nella finestra di dialogo della dimensione del conteggio.

In questo modo si ottiene un passaggio di soglia importante. Quindi regola i cursori della soglia di intensità per creare un intervallo inclusivo che evidenzi gli oggetti scuri. Un buon punto di partenza su una scala è compreso tra zero e 1.500.

Ora applica un filtro di dimensione per escludere gli oggetti più grandi o più piccoli di un singolo worm. Vai al menu di misurazione e quindi seleziona il sottomenu di misurazione. Si apre la finestra di dialogo delle opzioni di conteggio delle dimensioni.

Impostare l'intervallo dell'area da 28 a 120.000 micron quadrati e l'intervallo perimetrale da sei a 2.500 micron. Apportare modifiche a questi parametri quando si utilizzano vermi di dimensioni anomale. Ora, completa il processo di tracciamento facendo clic.

Continua nella finestra di dialogo di tracciamento. Ricontrolla che l'output segua le tracce con il filmato. Assicurati che tutti siano rappresentati, a meno che non ci sia un motivo chiaro per filtrarlo.

Quindi elimina manualmente le tracce prodotte da oggetti non worm. Successivamente, calcola la velocità di ogni verme facendo la media della distanza percorsa tra ogni fotogramma o ogni secondo e crea una velocità media per le tracce in ogni popolazione. Considera questa media finale come un punto campione per l'analisi statistica dell'esperimento.

Diversi genotipi con controlli sono stati analizzati utilizzando il protocollo descritto. Dopo 10 minuti di esposizione all'etanolo, i ceppi sensibili differivano nella locomozione dal loro controllo. Questo è contrassegnato dal grado di effetto sull'asse sinistro del grafico.

Il punto di vista semplice è che le stranezze, che mostravano una velocità relativa maggiore di quella del controllo, erano considerate resistenti all'etanolo, mentre le varietà con una velocità relativa inferiore ai controlli erano considerate sensibili all'etanolo. Confrontando i dati di 30 minuti di esposizione all'etanolo con quelli di 10 minuti di esposizione all'etanolo ha fornito un indice di tolleranza funzionale acuta all'etanolo o a FT. Una discussione estesa di questo e di altri risultati è fornita nel protocollo di testo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare il trasferimento di cibo sulla piastra di analisi.

Seguendo questa procedura, l'impatto del genotipo sugli effetti comportamentali di altri farmaci può essere eseguito al fine di rispondere a ulteriori domande come quali sono i meccanismi d'azione condivisi tra i diversi farmaci.