세포 내 칼슘의 두 광자 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 이광자 현미경을 사용하여 갓 분리한 혈관 내의 칼슘 또는 일산화질소를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 혈관을 기계적으로 분리하고 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 혈관을 칼슘 표지 염료 또는 nitronic acid가 포함된 O 표지 염료 내에서 배양합니다.

그 다음, 두 광자 이미징(two photon imaging) 동안 안정적인 시야를 확보하기 위해 그리드와 핀을 사용하여 용기를 실리콘 코팅 디시에 고정합니다. 마지막으로 두 광자 이미징을 수행하고 그 결과를 정량화합니다. 이 비디오는 세포 외 칼슘 농도 변화에 반응하여 분리된 혈관 내피세포의 세포 내 칼슘 신호 전달이 상승하는 모습을 보여줍니다.

최종적으로 이 방법은 연구자가 갓 분리한 혈관의 내피세포 또는 평활근세포에서 칼슘 또는 산화질소의 변화를 모니터링할 수 있게 해줄 것입니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 혈관 조직 내 세포 내 과정에 대해 더 나은 신호 분해능과 정밀한 측정을 제공할 수 있다는 점입니다. 본 연구에서는 이 기술을 고전적인(기하학적 다이스가 아닌) 다이스와 결합하여 적용함으로써, 분리된 중공 기관의 개별 세포에서 칼슘 과도 현상과 산화질소 생성을 측정하였습니다.

우리는 이 기술이 서로 다른 혈관 세포 유형 내에서 세포 내 칼슘 및 산화물 수준을 조절하는 메커니즘에 대한 지식을 발전시키는 데 도움이 될 것이라고 믿습니다. 살아있는 세포, 특히 혈관과 같은 온전한 조직의 이광자 여기 현미경 이미징은 고해상도 신호와 낮은 초점 외 배경 형광이라는 장점을 제공합니다. 이광자 여기의 좁은 국소화는 조직 내의 단일 초점 부피만을 조명하여, 초점 외 흡수를 크게 줄이고 빛 산란을 감소시킴으로써 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 포함하여 자가 형광이 강한 조직 내의 형광체 역동성을 이미징할 수 있게 합니다.

해부 현미경 하에서 텍스트 프로토콜에 따라 쥐의 대동맥을 분리한 후, 미세 팁 핀셋과 미세 가위를 사용하여 대동맥에서 지방과 결합 조직을 제거합니다. 세척이 완료되면 장기를 세로로 절단하고, 나중에 사용하기 위해 생리식염수(PSS)로 옮깁니다. 로딩 칵테일을 준비하려면, 칼슘이 포함되지 않은 PSS 450 µL에 기성품 1 mM Fluo-4 AM 염료 및 DMSO 용액 7 µL를 첨가합니다.

그 다음, 아세트 메틸 에스테르의 분산을 돕고 칼슘 염료의 로딩을 개선하기 위해 DMSO가 포함되지 않은 10%onic acid 용액 40 µL를 로딩 칵테일에 첨가합니다. 적출한 대동맥을 로딩 칵테일이 들어 있는 500 µL 튜브에 넣습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 상온의 회전 쉐이커에서 1시간 동안 반응시킵니다.

텍스트 프로토콜에 따라 대동맥 조직을 실리콘 코팅 접시 표면에 고정한 후, 접시를 정립형 이광자 현미경의 노즈피스 아래에 배치하고 25배 수침 대물렌즈를 시료 위에 설치 및 정렬합니다. 현미경 포트에 해당하는 방출 필터를 설치하십시오. 소프트웨어를 사용하여 이광자 적외선 레이저를 활성화하고, 투과광 상태에서 레이저 여기 파장을 820 nanometers로 조정합니다. 대물렌즈의 조동나사를 사용하여 대동맥의 위치를 찾고 대물렌즈의 초점을 내피 세포 표면에 맞춥니다.

현미경을 이광자 레이저 스캐닝 모드로 전환하고, 여기 레이저가 모드 잠금(mode locked) 상태인지 확인하십시오. 비 DS 스캔 검출기를 약 5~10%의 레이저 출력으로 작동시킵니다. 라이브 스캐닝을 시작하십시오.

마지막으로, 대물렌즈를 조절하여 내피세포 또는 평활근 세포의 초점을 맞춥니다. 실험 프로토콜 텍스트에 따라 연속 이미지를 수집하십시오. 이미지 처리 및 계산을 수행할 수 있도록 메타데이터가 포함된 형식으로 이미지를 저장하고, GNU 일반 공중 사용 허가서(GPL) 하에 배포되는 Fiji 이미지 처리 패키지를 다운로드하여 설치하십시오.

소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 프롬프트가 나타나면, Fiji 프로그램 내에서 데이터 분석을 위해 형광 채널만 사용하도록 투과광과 형광 채널을 분리하십시오. 분석(analyze) 탭을 클릭하고 도구(tools) 옵션까지 스크롤하여 내려갑니다.

그런 다음 ROI 매니저 탭을 클릭하면 새 창이 나타납니다. 다음으로, 분석 탭 아래에서 측정 항목 설정(set measurements)을 클릭하고 관심 있는 특정 측정 항목을 선택합니다. 이는 칼슘 과도 현상(calcium transient) 측정을 위한 것입니다.

평균 회색조 값(mean gray value) 옵션을 사용하십시오. 그다지 원형 트레이스 도구로 관심 영역을 트레이스하기 시작하고, ROI 매니저에서 선택한 각 ROI마다 추가(add)를 클릭하십시오. 관심 있는 모든 세포의 트레이스가 완료되면, ROI 매니저의 more 탭에서 다중 측정(multi mesure)을 선택하십시오.

마지막으로, 측정값을 직접 저장하거나 스프레드시트에 복사하여 붙여넣은 후 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행하십시오. 이 비디오에서 설명한 프로토콜을 사용하면 대동맥의 내피세포는 그 형태와 강한 형광 신호 덕분에 쉽게 찾을 수 있습니다. 내피세포와 동일한 시야에서 평활근세포 또한 관찰될 것이며, 이는 두 세포 유형이 서로 다르면서도 공동으로 다양한 작용제 및 자극에 어떻게 반응하는지를 더 잘 이해하게 하여 본 방법의 유용성을 입증해 줄 것입니다.

아세틸콜린 또는 내피의 강력한 칼슘 의존성 혈관 확장제인 CHA에 대한 반응 측정은 여기에서 보여주는 바와 같이 수행되었습니다. CHA를 첨가하면 PSS만 처리한 세포와 비교하여 내피세포의 형광이 증가하며, 이는 세포 내 칼슘 함량이 빠르게 증가했다가 서서히 기저선으로 돌아오는 것을 나타냅니다. 이 프로토콜은 내피의 산화질소 생성 검출에도 적합합니다. 본 실험에서는 대동맥 내피세포에 DAF FM DA를 로딩하였습니다.

Dye ENO 생성은 CH 자극에 반응하여 칼슘 의존적 방식으로 증가하였으며, 이러한 반응은 혈관 내피 OCH 합성효소 억제제인 L name에 의해 차단되었습니다. 이 방법은 심혈관 생리학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 설명된 실험 절차를 가용한 여러 유전자 변형 동물 모델과 함께 사용함으로써, 기초 및 중개 연구에서 두 광자 현미경의 FAR FSA 응용에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

이 접근법을 사용하면 혈관 세포 내의 특정 세포 내 신호 전달 경로에 대한 심층적인 이해와 기전적 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 갓 분리한 혈관의 개별 세포 내 칼슘 및 일산화질소 수치를 실시간으로 모니터링하기 위해 이 기술을 적용하는 방법을 배우게 될 것입니다.