이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

이 절차의 전체적인 목표는 이온 선택적 자기 참조 미세 전극 기술을 사용하여 생체 내(in vivo) 세포 외 이온 흐름을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 이온 선택적 전극과 참조 미세 전극을 조립함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이온 선택적 자기 참조 미세 전극을 교정하고 검증하는 것입니다.

다음으로, 전압 기록의 형태로 생물학적 시료의 이온 특이적 플럭스 측정을 수행합니다. 마지막으로, 전압 기록을 이온 플럭스로 변환합니다. 궁극적으로, 이 기술을 통해 살아있는 세포 또는 조직에서 특정 세포외 이온 플럭스를 비침습적으로 정확하게 측정할 수 있습니다.

이 방법은 재생이나 병리학뿐만 아니라 생리학 또는 노화의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법을 통해 조직 형태 형성 성장 또는 분화와 같은 생물학적 과정을 조절하는 특정 이온 흐름을 식별할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 포스닥인 Dr.Gim Ardi와 Dr.Benjas 연구실에서 진행합니다. 전극 교정 장착 전, 1 mm 금제 수형 커넥터와 염화은 코팅 은선이 장착된 미세 전극 홀더에 미리 채워진 이온 선택성 전극을 장착하십시오.

그 다음 마이크로 전극 홀더를 3축 컴퓨터 제어 전자 마이크로 포지셔너에 부착합니다. 이온 선택성 전극 자체에는 이미 전해질과 분석 대상 이온에 해당하는 이온 포어 칵테일 용액이 포함되어 있어야 합니다. 장착이 완료되면 전극을 1mM 염화칼륨 용액에 담급니다.

또한, 한천(agar) 내의 3 M 염 용액, 염화은(silver chloride)이 코팅된 은 펠릿 및 기준 전극용 2 mm 금 수단자(gold male connector)가 포함된 직선형 마이크로 전극 홀더에 기준 전극을 장착하십시오. 염 용액의 선택은 측정하려는 이온 종에 따라 달라집니다. 기준 전극을 준비한 후, 전극 홀더를 마그네틱 스탠드에 미리 장착된 수동 마이크로 포지셔너에 연결하십시오.

전극을 장착한 후, 1 mM 염화칼륨 용액에 담가야 합니다. 시작하기 전, 이온 선택성 전극 장치를 위해 분석 대상 이온이 포함된 전해질 교정 표준물질의 희석 계열을 준비하십시오. 예를 들어, 약 1 mM의 생리학적 농도에서 칼륨 양이온을 검출하려는 경우, 10, 1, 0.1 mM 농도의 염화칼륨 용액으로 3-log 계열을 제조하십시오.

이는 분석에 필요한 검출의 동적 범위를 최대화합니다. 이온 선택 전극을 보정하려면, 먼저 이온 선택 전극과 참조 전극 모두를 가장 농도가 낮은 보정 용액(이 경우에는 0.1 millimolar)에 담급니다. 실온에서 1~3분 동안 짧게 안정화시킨 후, 정상 상태 전압을 측정하여 기록합니다.

나머지 검정 표준물질들에 대해 전압 측정을 반복하고, 측정된 전압을 몰 이온 농도의 로그 값에 대해 도식화하십시오. 각 표준 용액에 대해 선형 회귀 분석을 적용하여 검정 곡선의 기울기, 절편 및 결정 계수(R² 값)를 확인하십시오. 네른스트 기울기를 계산할 때는 측정된 전압을 전압 증폭기의 총 이득으로 나누어야 함을 유의하십시오.

측정 프로토콜을 시연하기 위해, 칼륨 민감성 미세 전극을 사용하여 천공된 개구리 난모세포로부터의 칼륨 이온 유출을 분석합니다. 이온 선택성 전극 설정을 시작하기 전, 800 µm 나일론 메시에서 1 cm 크기의 조각을 잘라 플라스틱 페트리 접시에 접착합니다. 또한, 다음과 같은 조성의 Mark 변형 링거액을 미리 준비합니다: 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ 및 5 mM HEPES. 수산화나트륨을 사용하여 버퍼의 pH를 7.5로 조절하고, 완성된 버퍼의 일정량을 페트리 접시에 넣습니다.

개구리 세포, 이온 선택 전극 및 참조 전극을 페트리 접시에 조심스럽게 배치합니다. 그런 다음 세포를 천공하고 마이크로 포지셔너를 작동시켜 이온 선택 전극이 시료로부터 약 10 microns 거리에 위치하도록 합니다. 명칭상 시료와 전극 사이의 현재 거리를 근접 위치(close position)로 지정합니다.

다음으로, 이온 선택 전극이 10 µm의 근접 위치에서 100 µm의 원거리 위치로 주기적으로 이동했다가 다시 근접 위치로 돌아오도록 마이크로 포지셔너를 작동시키며, 이때 이동 속도는 0.3 Hz, 즉 10초당 3회 왕복하도록 설정합니다. 마이크로 포지셔너 작동 중에 전극의 이동 방향이 세포의 손상된 접선 표면에 대해 정확히 수직인지 확인하고, 전압 측정 및 기록 소프트웨어를 활성화합니다. 마이크로 포지셔너는 전압 데이터가 수집되는 동안 근접 위치와 원거리 위치에서 잠시 멈추도록 프로그래밍되어 있습니다.

난모세포 상처 치유 과정 중에는 데이터가 지속적으로 기록되며, 이는 더 긴 실험의 경우 약 15분 정도 소요됩니다. Opus 올챙이 꼬리 재생 측정과 같이 며칠에 걸친 과정을 관찰하는 경우에는 1, 3, 6, 12, 24시간 등 서로 다른 시점에서 각각 2분 동안 측정을 수행합니다. 실험이 완료되면 전압 데이터를 텍스트 파일로 추출하여 해당 값들을 스프레드시트에 복사하십시오.

이전에 결정한 검정 곡선을 사용하여 측정된 전압 값을 그에 해당하는 이온 농도로 변환하십시오. 외삽된 이온 농도를 생물학적 시료로부터의 거리의 함수로 도식화하십시오. 마지막으로, 픽의 확산 법칙(Fick's law of diffusion)을 사용하여 이온 플럭스를 계산하십시오.

여기서 C는 용액 내의 이온 농도, MU는 이온 이동도, DC DX는 거리 dx에 따른 농도 차이를 나타냅니다. 생물학적 실험에 앞서, 이온 선택성 전극의 NER 기울기 절편 값과 전체 교정 곡선을 페트리 접시에 배치한 1 M 이온원으로부터 생성된 인공 이온 구배를 통해 검증할 수 있습니다. 칼륨 이온 농도의 변화를 annu 부위 상처와 가깝거나 먼 거리에서 도식화하여 분석합니다.

데이터에 따르면 세포 손상 시작 시점에 대규모 칼륨 유출 이벤트가 발생하며, 상처 치유가 진행됨에 따라 칼륨 유출은 점차 감소하여 상처가 완전히 치유되는 15분 후에 정지 상태의 수준으로 돌아갑니다. 또한, 측정된 칼륨 이온 농도를 이온 유속으로 변환했을 때, 손상 후 칼륨 유속의 급격한 증가와 점진적인 감소는 손상되지 않은 대조군 난모세포와 비교했을 때 통계적으로 유의미한 효과인 것으로 나타납니다. 이 절차 이후에는 세포 간 및 세포 내 이온 유속의 특성에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 형광 생체전기 표지법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.