미세 패턴 혈관 근육 박막의 확장 문화 미세 유체 Genipin 증착 기술

이 절차의 전반적인 목표는 질병 관련 시간 범위 내에서 뇌혈관 경련과 같은 혈관 기능 장애의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있는 평활근 수축 기능의 인비트로(in vitro) 모델을 개발하는 것입니다. 이는 커버슬립에 piam 스트립과 PDMS를 순차적으로 스핀 코팅하여 엘라스토머 기질을 먼저 준비함으로써 장기 혈관 근육 박막을 통해 달성됩니다. 두 번째 단계는 미세유체 증착 장치를 사용하여 표면에 제닌과 피브로넥틴을 순차적으로 증착하는 것입니다.

혈관 및 근육 박막 상에서 조직의 자기 조직화를 위한 안내 단서를 제공하기 위해, 마지막 단계로 샘플을 이미지화하면서 수축과 이완 수축을 유도하여 혈관 및 근육 박막의 수축성 분석을 수행합니다. 궁극적으로 이 접근 방식은 배양 시 최대 2주 동안 구조적 충실도와 기능적 수축성을 유지하는 조직을 생성합니다. 마이크로 접촉 인쇄 근육 박막과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이전 방법으로 구축된 조직은 3~4일 후부터 분해되기 시작하는 반면, 이 방법은 조직의 무결성과 기능적 수축성이 수주 동안 유지된다는 점입니다.

배양 환경에서, 이 방법은 만성 질환의 진행 과정 동안 동맥의 기능적 역학이 어떻게 변화하는지와 같은 혈관 질환의 핵심 질문들을 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 연구에서는 혈관 역학을 분석하고 있으나, 이 방법은 심장 또는 골격근 기능을 재현하기 위한 오가노이드 칩 기술과 같은 다른 모델 장기 시스템에도 적용될 수 있습니다. 저희는 서서히 진행되는 혈관 기능 장애를 연구하고자 했으나, 기존의 방법들이 혈관 평활근 세포의 기능을 정량화하는 데 부적합하거나 충분한 기간 동안 무결성을 유지하지 못한다는 점을 발견하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다.

Jin 미세유체 증착법은 마이크로 접촉 인쇄와 유사한 방식으로 세포 자기 조직화를 위한 템플릿을 제공하며, 패턴 조직이 혈관 재형성 연구에 적합한 시간 동안 그 구조와 무결성을 유지할 수 있게 합니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 25 millimeter 직경의 유리 커버슬립 일괄분을 세척합니다. 세척된 커버슬립의 측면에 접착 테이프를 붙여 가장자리를 덮고, 중앙에 유리 띠가 노출되도록 합니다. 그다음, 커버슬립을 접시에서 분리하여 하나씩 스핀 코팅 척 위에 배치합니다.

포셉을 사용하여 1-부탄올에 용해된 10% poly N-isopropylacrylamide(poly PAM 또는 PIAM이라고도 함) 용액 150 µL를 추가합니다. 커버슬립의 노출된 부위가 완전히 덮이도록 하십시오.

그 다음 스핀 코터를 켜고 10초 동안 속도를 3000 RPM까지 올립니다. 5초간 대기한 후 다시 10초 동안 6,000 RPM까지 올립니다. 6,000 RPM에서 1분 동안 유지한 다음, 10초에 걸쳐 속도를 다시 3000 RPM으로 내립니다.

스핀 코팅 사이클을 마치기 전 5초 동안 그 상태를 유지합니다. 건조 후, 모든 커버슬립에서 접착 테이프를 조심스럽게 제거하여 유리 커버슬립 중앙에 얇은 piam 코팅층이 형성된 전체 커버슬립이 노출되도록 합니다. 다음으로, 각 커버 위에 Degas PDMS 층을 스핀 코팅합니다.

90°C 오븐에서 최소 1.5시간 동안 슬립 및 경화시킵니다. 조직 미세유체 광마스크를 설계한 후, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 따라 패턴 실리콘 웨이퍼를 준비합니다. 패턴 형성이 완료되면 표준 기술을 사용하여 웨이퍼를 식각하고, 패턴 면이 위로 향하게 하여 페트리 접시에 놓습니다.

다음으로 10:1의 가교제 비율로 PDMS 100g을 혼합합니다. PDMS를 디쉬에 부어 패턴 웨이퍼를 완전히 그리고 균일하게 덮습니다. 모든 기포가 제거될 때까지 디쉬를 진공 데시케이터에 약 30분 동안 둡니다. 그 후 90 °C에서 최소 1.5시간 동안 디쉬 내의 PDMS를 경화시킵니다.

경화가 완료되면, 과잉 PDMS를 잘라내고 패턴이 형성된 웨이퍼 쪽에서 패턴화된 PDMS를 천천히 떼어냅니다. 면도날을 사용하여 패턴 주변의 과잉 PDMS를 잘라내고, 이후 단계에서 장치를 쉽게 제거할 수 있도록 장치 모양을 직사각형으로 만듭니다. 다음으로, 1 mm 수술용 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구 구멍을 모두 형성합니다.

매 사용 전, 마이크로유체 장치를 70% ethanol에서 최소 30분 동안 초음파 처리하십시오. 최대 10개의 혈관 평활근 박막 기판 커버 슬립을 자외선 오존 세정기에 넣고 8분 동안 처리하십시오. 다음으로, 동결 건조된 genin 5 mg 용기에 멸균 2차 증류수 1 mL를 첨가하여 5 mg/mL genin 용액을 준비하십시오.

볼텍스 믹서를 사용하여 용액을 혼합하고, 상온에서 최소 30분 동안 바이알을 그대로 둡니다. 세척된 미세유체 소자의 기능성 면이 아래로 향하도록 각 커버 위에 배치합니다. 한 번에 하나씩 밀어 넣으십시오.

PDMS가 코팅된 커버슬립에 밀착되도록 장치를 강하게 누릅니다. 장치 프라이밍을 위해 각 장치의 입구에 70% 에탄올 한 방울을 빠르게 떨어뜨립니다. 5~10분 후, 입구의 과잉 에탄올을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 즉시 약 100 µL의 PBS로 교체합니다.

진공 장치를 사용하여 PBS를 장치 배출구까지 통과시켜 에탄올을 씻어냅니다. 입구에 소량의 PBS만 남았을 때 중단하십시오. 그런 다음 각 입구에 5 mg/mL 제닌(genin) 용액 60 µL를 넣고, 배출구에 진공 흡입 팁을 교체하여 제닌 용액이 장치를 통과하도록 당겨줍니다.

입구에 소량의 용액만 남았을 때 흡입을 중단하십시오. 그다음, 용액이 마르는 것을 방지하기 위해 입구와 출구 양쪽에 PBS를 몇 방울씩 떨어뜨립니다. 배양 단계에서는 장치가 담긴 디쉬를 37°C로 설정된 습윤 오븐 또는 인큐베이터로 옮겨 4시간 동안 배양하십시오.

배양 과정 동안, 피브로넥틴(fibronectin)을 멸균 2차 증류수에 50 µg/mL 농도로 재용해하고 Jin과 함께 배양한 후 최소 30분 동안 얼음에 보관하십시오. 유입구로 최소량의 PBS를 통과시키십시오. 다음으로, 50 µg/mL 농도의 피브로넥틴 용액 100 µL를 넣으십시오.

각 유입구에서 진공 흡입기 팁을 사용하여 장치 내부로 용액을 끌어당깁니다. 유출구 쪽에서는 장치가 들어 있는 뚜껑 없는 디쉬를 37°C로 설정된 오븐 또는 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 한 손으로 커버슬립을 가볍게 잡고 다른 손으로는 장치의 모서리를 천천히 벗겨내어 커버슬립에서 장치를 조심스럽게 제거한 다음, 커버슬립을 멸균된 6-웰 디쉬에 넣습니다.

각 웰에 최소 5 mL의 페니실린 스트렙토마이신 용액을 넣고, 배양 접시를 37 °C의 멸균 인큐베이터에 최소 30분 동안 둡니다. 멸균 후, 페니실린 스트렙토마이신 용액을 흡입하여 제거하고, 배양된 인간 제C배꼽동맥 혈관 평활근 세포를 80,000 cells/cm²의 농도로 커버슬립에 파종합니다. 테스트 전, 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 24시간 동안 배양합니다.

테스트를 시작하려면, 100 millimeter 접시에 조직 샘플을 넣습니다. 샘플이 잠길 정도로 pH 7.4의 멸균된 예열 tyro 용액을 추가합니다. 면도날을 사용하여 세포 시트의 파이프 암 가장치와 수직이 되도록 여러 번의 평행 절개를 수행합니다.

약 2mm 두께의 더 넓은 조직 절편이 생기도록 절개합니다. 이것이 나중에 제거될 얇은 조각들과 교대로 배치될 혈관 근육 박막이 됩니다. 그런 다음 디쉬를 90도 회전시키고, piam 조각과 평행하게 조직 중앙에 두 개의 직선 평행 절개를 수행합니다.

인접한 필름들이 서로 접촉하지 않도록 혈관 및 근육 박막 사이의 얇은 스트립들을 제거합니다. 그다음, 디시를 실체 현미경 스테이지 위의 온도 조절 플랫폼에 놓고, 처리 분석 과정 동안 원하는 간격으로 타임랩스, 투과광 및 형광 이미지를 캡처하기 시작합니다. 혈관 근육 박막에 50 nM의 endothelium one을 20분 동안 처리하여 수축을 유도하고, 이어서 32 °C 이하로 냉각한 상태에서 100 µM의 HA 10 77을 30분 동안 처리하여 이완을 유도합니다.

피막(Piam)이 용해되면서 혈관 근육 박막이 방출됩니다. 투영 길이의 측정값은 곡률 반경으로 변환될 수 있으며, 이는 대표적인 수축성 분석의 순차적 투과광 이미지에서 보여지는 필름 상의 세포층 내 평균 응력을 계산하는 데 사용됩니다. 이러한 이미지들은 응력 값으로 변환될 수 있으며, 이를 통해 기저 긴장도와 유도된 수축성이 계산됩니다.

이 영상에서는 전체 수축성 분석의 대표적인 타임랩스가 제시됩니다. 근육 박막이 수축 평형 상태에 도달한 후, 50 nM 엔도텔린을 첨가하자 더욱 수축합니다. 이후 100 µM HA 10 77을 첨가하자 하나의 박막이 이완됩니다.

분석 종료 시점에서 기저 톤과 조직 수축력이 약간 감소한 것은 조직을 구성하는 세포 수가 감소한 결과일 가능성이 높습니다. 혈청 기아 상태의 혈관 평활근 세포는 증식하지 않으므로, 여기서는 1일에서 2주까지의 다양한 희생 시점에서 제닌(genin) 변형 표면에서 배양된 평활근 세포의 위상차 이미지를 보여줍니다. 여기서는 혈청 기아 상태가 1일, 4일, 7일 경과한 후 F-actin 필라멘트를 녹색으로 염색하여 조직의 합류도와 세포 정렬을 강조하기 위해 면역조직화학법을 사용하였습니다.

이 기간 동안 조직 합류도(confluence)를 정량적으로 평가한 결과, 해당 표면에서 최소한의 성능 저하만이 나타났습니다. f actin 필라멘트의 정렬 상태를 정량화하여 분석한 결과, 2주 동안 정렬이 유지됨을 확인하였습니다. 배양 시, 이 인비트로(in vitro) 조직 제작 기술을 숙달하면 이틀 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때, 예상되는 세포 파종 하루 전에 미세유체 증착을 시작해야 한다는 점과 핀 필름 실험 동안 일정한 생리적 온도를 유지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 Western blotting 및 PCR과 같은 전통적인 생화학적 방법을 수행하여 단백질 및 유전자 발현의 변화를 연구함으로써 세포 표현형과 기능적 행동의 상관관계를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 뇌혈관 경련, 고혈압, 동맥경화증과 같이 천천히 진행되는 혈관 기능 장애의 진행 과정과 인간 동맥벽의 인비트로(in vitro) 모델을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.