마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 전사 인자 종속 규정을 설명

이 방법론의 전반적인 목표는 관심 있는 전사 인자(transcription factor)가 microRNA 전사체를 조절하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 단백질 코딩 유전자의 전사를 조절하는 전사 인자(transcription factor)가 microRNA의 전사에도 관여하는지 여부에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 데이터 마이닝, 실험실 데이터 및 생물정보학 분석을 통합하여 관심 전사 인자의 활성에 따라 달라지는 microRNA 유전자 전사에 대한 포괄적인 설명을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 microRNA 유전자 전사의 상호 작용과 전사 인자 상태의 활성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 이는 설명적인 방법이며 이러한 연관성의 확인은 추가 분석을 사용하여 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 먼저 University of California Santa Cruz 게놈 브라우저와 같은 게놈 브라우저를 열어 염색질 면역침전 염기서열분석 데이터를 추출합니다. 사이트에 접속하면 상단 메뉴로 이동하여 도구를 선택하고 테이블 브라우저를 엽니다.

여기에 표시된 대로 사양을 해당 상자에 입력한 다음 출력 가져오기를 선택하여 테이블을 추출합니다. 출력을 텍스트 파일로 저장합니다. 그런 다음 파일을 스프레드시트로 가져옵니다.

스프레드시트 프로그램에서 이름 열을 정렬하고 STAT2와 같은 관심 있는 전사 계수에 대한 결과를 필터링합니다. 그런 다음 H3K4me3 후성유전학적 시그니처를 기반으로 microRNA 프로모터 목록을 복사하고 목록을 txt 파일에 붙여넣습니다. 그런 다음 SQL로 작성되고 추가 데이터 파일에 제공된 추가 코드를 사용하여 수집된 데이터를 매핑하고 중간 바인딩 선호도를 확인합니다.

먼저 10cm 접시에 150만 개의 HEK293 세포를 추가하고 10%FBS가 보충된 DMEM을 추가합니다. 약 50%confluency에 도달할 때까지 24시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 미디어를 교체합니다.

그런 다음 제조업체 지침에 따라 표적 shRNA를 함유한 5마이크로그램의 녹색 형광 단백질 렌티바이러스와 5마이크로그램의 패키징 벡터와 결합된 형질주입제를 추가합니다. 대조군으로, 스크램블된 shRNA와 패키징 벡터를 사용하여 동일한 세포 플레이트를 transvect합니다. 세포에서 transvection mix를 16시간 동안 배양한 다음 배지를 10% FBS가 보충된 10ml의 새로운 DMEM 배지로 변경합니다.

transvection 후 48시간이 지나면 세포에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 감염성 상층액을 수집하기 위해 5분 동안 원심분리기를 사용합니다. 0.45 미크론 주사기 필터를 통해 상층액을 여과하여 부유 세포를 제거합니다.

다음으로, 임계값이 100킬로달톤인 초원심 필터 장치에 매체를 추가합니다. 부피가 250마이크로리터 미만이 될 때까지 매체를 원심분리하여 렌티바이러스를 농축합니다. 남은 액체를 냉동 튜브에 옮기고 농축된 바이러스를 섭씨 영하 80도에서 필요할 때까지 보관합니다.

계속할 준비가 되면 영하 80도 냉동고에서 얼린 렌티바이러스를 꺼내 바이알을 실온으로 가져옵니다. 100마이크로리터의 바이러스 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로분리 튜브에 옮기고 혈청 없이 900마이크로리터의 배지를 추가합니다. 다음으로, 1밀리리터 바이러스 현탁액에 밀리리터당 10나노그램의 헥사디메스린 브로마이드를 추가합니다.

튜브를 부드럽게 섞고 혼합물을 5분 동안 그대로 두십시오. 계획된 각 형질도입을 위해 500만 개의 세포를 채취한 다음 바이러스가 포함된 0.5ml의 배지에 세포 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 세포를 12-well 플레이트로 옮기고 4-24시간 동안 배양합니다.

그런 다음 20%FBS를 함유한 배지 0.5ml를 추가합니다. 형질도입 후 48-72시간에 세포를 채취하여 제조업체의 지침에 따라 프로피듐 요오드화물로 염색합니다. 염색 후 세포를 빛으로부터 보호하고 GFP 양성, 프로피듐 요오드화물 음성 세포의 비율을 측정하여 transvection 효율을 추정하기 위해 사실을 사용합니다.

그런 다음 분류된 GFP 양성 세포 집단을 수집하고 단백질을 추출합니다. 마지막으로, 웨스턴 블로팅(western blotting)을 사용하여 지정된 shRNA로 세포를 감염시키기 전과 후의 표적 전사 인자(targeted transcription factor)의 수준을 측정합니다. CLL 세포와 STAT3 shRNA의 transvection 후, STAT3 mRNA와 STAT3 단백질의 수치가 모두 현저히 감소했습니다.

또한, CLL 세포의 microRNA 어레이는 STAT3 shRNA로 trasnfection된 CLL 세포와 빈 벡터로 transvection된 CLL 세포 간에 발현이 크게 다른 23개의 microRNA를 묘사했습니다. microRNA 어레이의 결과는 정량적 RT-PCR을 사용하여 여기에 표시된 7개의 유전자에 대해 검증되었습니다. 이 절차에 따라 염색질 면역침전 및 전기이동성 이동 분석 및 차이 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 이 전사 인자가 특정 거울 유전자의 프로모터와 결합하고 활성화하는지 검증할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 생물 정보학 분석, 공개적으로 사용 가능한 데이터를 통합하고 shRNA 접근 방식을 사용하여 전사 인자를 침묵시키는 방법을 잘 이해하여 이 전사 인자가 microRNA 유전자의 발현을 조절하는 방법을 찾을 수 있습니다.