Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di raccogliere le proprietà meccanobiologiche rilevanti da singole cellule isolate visualizzando le forze delle loro caratteristiche interazioni con il substrato cellulare utilizzando la microscopia ottica standard. Il metodo presentato è una piattaforma tecnologica per la meccanobiologia. Può aiutare a indagare su questioni chiave nella ricerca sul cancro, come il ruolo della contrazione cellulare nelle metastasi delle cellule tumorali.

I principali vantaggi della tecnica sono che estrae in modo robusto le informazioni neurobiologiche con poca formazione dell'utente. È compatibile con la microscopia ottica standard ed è orientato verso un'elevata produttività. In terzo luogo, questo metodo fornisce informazioni sulle proprietà meccanobiologiche delle cellule tumorali ossee umane.

Può essere applicato anche a tipi di cellule auto, come le cellule muscolari lisce o i cardiomiociti. Inizia posizionando il substrato di vetro in modo che il micro post array sia rivolto verso l'alto nel pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, aggiungi indirettamente un millilitro di etanolo al 99% al pozzetto in modo che il substrato sia coperto. Assicurarsi che non vi siano bolle durante le fasi di manipolazione del liquido e che il micro post array sia sempre coperto da un sottile strato di liquido.

Quindi incubare l'array a temperatura ambiente per 20-30 secondi prima di aggiungere un millilitro di acqua deionizzata sterile sul lato del pozzetto. Una volta miscelato con l'etanolo, aspirare circa un millilitro della soluzione di etanolo dal pozzetto e aggiungere un ulteriore millilitro di acqua deionizzata. Ripetere questo processo almeno tre volte per bagnare il campione.

Successivamente, sostituire l'acqua deionizzata nel pozzo con PBS allo stesso modo aggiungendo e poi aspirando circa un millilitro alla volta per tre ripetizioni. Quindi utilizzare lo stesso processo per sostituire il PBS con il medio. Ora che l'array è coperto con circa un millilitro di terreno, pipettare 25.000 cellule di interesse in un millilitro di terreno nel pozzetto con un micro post array preparato.

Quindi chiudere la piastra multipozzetto e trasferirla in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Lascia che le cellule aderiscano e crescano sopra i micro perni per sei o sette ore, ispezionando il processo di adesione. Di tanto in tanto, utilizzando un microscopio ottico, aspirare il terreno dal pozzetto e quindi lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS.

Assicurarsi di applicare una forza delicata durante il lavaggio con PBS per rimuovere i detriti cellulari accumulati sul micro post array durante l'incubazione e per staccare le cellule morte. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di una soluzione di formaldeide tamponata al 3,7% per cinque minuti per fissare le cellule. Quindi rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare due volte il micro post array utilizzando un millilitro di acqua deionizzata sterile.

Per ogni lavaggio, coprire le celle fissate con colorante blu brillante kumasi allo 0,05% in 50% di acqua, 40% di etanolo e 10% di acido acetico per circa 90 secondi, lavare via la soluzione colorante in eccesso con due risciacqui in un millilitro di acqua deionizzata sterile. Quindi aggiungere un millilitro di acqua deionizzata al micro post array e controllare il risultato della colorazione al microscopio ottico. Inizia aggiungendo due millilitri di acqua deionizzata a una piastra di Petri con un fondo di vetro sottile usando un paio di pinzette, trasferisci l'array di micro post dalla piastra a 12 pozzetti nella capsula di imaging con un micro post rivolto verso l'alto.

Quindi posizionare la piastra di Petri per immagini sul tavolino mobile di un microscopio ottico. Se l'ottica del microscopio non è corretta all'infinito, ruotare l'anello di compensazione della lente utilizzata per l'imaging fino a quando il numero sulla scala rappresenta lo spessore totale di tutti i materiali lungo il percorso ottico. Quindi, rimuovere eventuali anelli di contrasto facciale dal percorso ottico per abilitare la normale modalità campo chiaro, quindi ridurre l'iride sul lato di illuminazione fino al 50%Allineare la piastra di Petri in modo che i micro perni dell'array formino una linea orizzontale o verticale attraverso il campo di osservazione.

Definisci un punto di partenza in alto a sinistra e sposta la piastra di Petri passo dopo passo sul palco. Scansione del micro post array mentre si scattano numerose immagini ad alta risoluzione con un obiettivo 20x o 40x. Cerca di avere una singola cella al centro di ogni immagine in ogni nuova posizione.

Scorrere lungo gli ZX dalla parte inferiore del micro perno verso la punta del micro perno finché la punta non è a fuoco. Utilizzando la rotella di regolazione fine del microscopio. Quindi abbassare il piano di messa a fuoco di due o tre micron verso la parte inferiore del micro perno.

Inizia caricando il software mec, il profiler e caricando una serie di immagini che devono essere analizzate facendo clic su Apri e selezionando le immagini. Successivamente, vai alla sezione delle impostazioni e inserisci i parametri come indicato nel manuale del software. Quindi analizza le immagini una per una.

Inizia selezionando il pulsante di ritaglio, quindi fai clic e trascina per formare un contorno rettangolare attorno all'area di interesse. Al termine, fai doppio clic all'interno del rettangolo disegnato per terminare l'azione. Quindi, seleziona disegna il contorno della cella e usa il cursore del mirino per disegnare un contorno attorno a tutti i micro pali coperti dalla cella visibile nell'immagine.

Elimina tutti i micro post indesiderati facendo clic su per scartare i post e usa il cursore del mirino per disegnare. Quindi racchiudi tutti i micro post che appartengono a una cella al di fuori della sezione dell'immagine o che vengono deviati per qualsiasi altro motivo, ma non dalla cella di interesse. Quindi, fai clic su Trova OID per avviare la subroutine del software.

Regola l'impostazione del filtro proprio accanto al pulsante Trova OID fino a quando tutti i micro post non vengono registrati, che è reso visibile da una croce rossa al centro. Se ci sono più posizioni di micro post o mancate, utilizzare la funzione di modifica manuale facendo clic su modifica manuale e utilizzare il mirino del mouse per selezionare il micro post in questione. Fare doppio clic all'interno del rettangolo e posizionare un singolo marcatore rosso nella sezione dell'immagine ingrandita, che si chiude automaticamente.

Trova la griglia di micro pali ideale attivando la funzione di generazione della griglia con un clic del mouse. Assicurarsi che la posizione corrisponda alla vera testa del micro palo mostrata da un anello blu all'interno della linea di contorno della cella disegnata. Quindi, correggi eventuali marcatori della griglia posizionati in modo errato all'interno dell'area della cella, se necessario.

Utilizzando la funzione di modifica manuale corrispondente con un clic del mouse, utilizzare il mirino per selezionare la domanda di micro pubblicazione facendo clic e trascinandola. Fare doppio clic all'interno del rettangolo visualizzato e posizionare l'indicatore blu corretto nella sezione dell'immagine ingrandita, che si chiude automaticamente. Quindi fare clic su calcola deflessioni per ottenere un istogramma dei valori di deflessione calcolati in base alla differenza tra la posizione di un micro palo all'interno della sezione dell'immagine e la griglia ideale generata.

Infine, salva l'analisi completa, comprese le tabelle dei valori. Continua l'analisi dell'immagine facendo clic su Ripristina visualizzazione per analizzare un'altra sezione dell'immagine o facendo clic su Mostra immagine successiva. Mostrato. Ecco un esempio di meno profilazione di due linee cellulari di cancro osseo Q o nove cellule, che hanno un basso potenziale metastatico, e le cellule M 132 altamente metastatiche erano posizionate su un rialzo dallo stesso lotto di produzione.

Il risultato mostra che le cellule Q oh nove tendono ad applicare più forza nei loro punti di attacco rispetto alle cellule altamente metastatiche classificando i valori di forza. Per quanto riguarda l'area cellulare, si scopre che la forza media per cella è elevata per huo nove celle rispetto a M 132. Inoltre, la forza media per micro palo aumenta man mano che le celle si diffondono fino a quando la forza media per palo raggiunge un valore più stabile.

Oltre alle differenze nelle varianze morfologiche, si possono quantificare con risultati interessanti. Ad esempio, a differenza delle cellule M 132 altamente metastatiche, che tendono ad occupare meno micro post, le cellule HU oh nove presentano un profilo più eterogeneo in termini di copertura di micro post. In breve, il profilo Meno per la linea cellulare parentale HU oh nine rivela che in genere coprono più area e applicano una forza leggermente maggiore ai micro perni.

Mentre la linea cellulare metastatica M 132 e il tipo di cella aggressiva coprono tipicamente meno micro perni e applicano meno forza per micro perno. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di convogliarlo con molta attenzione e mai direttamente sul micro post array. Evitando di introdurre bolle in quanto portano al collasso dei micro pali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre informazioni meno biologiche da singole cellule isolate utilizzando micro post Aries in combinazione con il nostro profilo mesh o software. Goditi i tuoi risultati.