유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

본 절차의 전반적인 목표는 배양된 단일 세포에서 항암 치료 반응을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 불균질한 치료 반응 및 세포 운명을 포함하여 암 연구 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 먼저, 인증된 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 텍스트 프로토콜에 따라 배양 인증 디시에 HT1080 세포를 준비하고, 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하십시오.

이미징 2일 전, 1.5번 유리 바닥 12-웰 플레이트의 필요한 웰당 50,000개의 HT1080 FuGENE 세포를 분주합니다. 실험 시작 시 약 60%의 합쳐짐(confluence) 정도에 도달할 수 있도록, 세포의 성장 속도와 사용한 플레이트에 따라 분주하는 세포 수를 조절하십시오.

환경 챔버를 습도 약 80%, 시료 위치의 온도는 37 °C로 설정하십시오. 제조사의 지침에 따라 수조에 멸균 증류수가 채워져 있는지 확인하십시오. 그런 다음 환경 챔버를 원하는 온도 설정으로 켜고, 이를 현미경 스테이지에 배치하여 설정하십시오.

스테이지 상단 챔버와 스테이지 인셋 사이에 빈 공간이 있는 경우, 챔버를 삽입하기 전에 스테이지 인셋 개구부의 가장자리에 파라핀 필름 조각을 덮어 챔버를 스테이지에 결합시키십시오. 두 경우 모두 모션 아티팩트를 유발할 수 있으므로, 연결 부위가 챔버를 당기고 있지 않은지 확인하십시오. 물이 담긴 더미 디쉬를 챔버에 넣고, 챔버가 37 °C로 평형을 이룰 때까지 기다린 후 안정적인 온도를 유지하십시오.

이미징 설정을 위해 현미경, 컴퓨터 및 필요한 주변 기기를 켭니다. 광원의 종류에 따라 필요할 때까지 전원을 켜지 말고 대기하십시오. 대물렌즈 터렛을 낮은 위치에 두고, 20x 0.7 개구수 대물렌즈를 선택하십시오.

그 다음 샘플을 대물렌즈 위에 배치하면, 샘플이 챔버 내에 있을 때 세포를 더 쉽게 찾을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미징할 세포를 환경 챔버로 옮긴 후, 안정적인 환경을 유지하기 위해 챔버를 밀봉하고 대기 가스를 켭니다. 다음으로, 노출 시간을 제한하고 낮은 강도의 빛을 사용하여 광독성을 방지할 수 있는 이미징 조건을 선택합니다.

X, Y, Z 평면과 이미지를 촬영할 각 위치에 필요한 파장을 설정합니다. 대부분의 세포 공정의 장기 타임랩스 촬영의 경우, 10분에서 20분마다 이미지를 한 장씩 획득하십시오. 시간 해상도가 높을수록 더 많은 데이터 포인트와 더 견고한 세포 추적이 가능하지만, 누적 광노출량이 증가하고 데이터 세트의 규모가 커집니다.

HT1080 FuGENE은 동적인 녹색 및 적색 형광 단백질을 가지고 있으므로, 다음의 노출 시간을 사용하고 2x2 빈(bin)을 설정하십시오. 고급 설정에서 기본 설정을 사용하여 소프트웨어 제어 자동 초점 기능을 활성화하십시오. 권장 단계 크기로 10 micrometers의 자동 초점 범위를 지정하십시오.

열 드리프트를 줄이기 위해 실험용 디쉬 내 배지의 절반을 37°C로 데운 원하는 약물이 포함된 배지로 교체하십시오. 마지막으로, 타임랩스를 시작하고 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 획득하십시오. 이 영상들은 p53 상태만 서로 다른 유방암 유래 MCF7 세포주 쌍의 예시를 보여주며, 이들은 kinesin-5를 억제하여 유사분열 정지를 유도하는 항암제로 처리되었습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 안정적인 p53 knockdown을 통해 p53을 제거하면, 세포는 유사분열 종료 후 정지하는 대신 정지하지 않고 두 번째 유사분열 단계로 진입하는 반복적인 사이클을 거치며 분열 없이 유사분열을 빠져나옵니다. 여기에는 mCherry가 융합된 염색질 마커 Histone 2b와 EGFP가 융합된 beta tubulin을 안정적으로 발현하는 자궁경부암 유래 Hela 세포가 나타나 있습니다. 미세소관 안정화 약물인 paclitaxol을 처리하면 유사분열 동안 염색체의 정렬과 분리가 방해받아, DNA 손상에 취약한 핵 팽대(nuclear bulges)와 미세핵(micronuclei)이 형성됩니다.

이 세포주는 CDT1(오렌지색)과 geminin(녹색)에 대한 두 가지 형광 유비퀴틴 세포 주기 지표를 안정적으로 공동 발현하며, 세포 주기를 정상적으로 진행합니다. 동일한 세포에 CDK46 억제제를 처리하면, 세포는 G2기를 거쳐 정상적으로 분열한 후 G1기에서 강력하게 정지하며, 이는 성장하는 종양에서 효과적인 세포 정지 효과를 나타낼 가능성을 시사합니다. 이 기술의 주된 장점은 이러한 반응을 추론하는 대신, 며칠 동안 단일 세포의 반응을 실시간으로 직접 관찰할 수 있다는 점입니다.