La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d'un système de transposon

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de reprogrammer les cellules du liquide amniotique murin à l’aide d’un système de transposon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à réaliser. Dans un cadre thérapeutique, les cellules de fœtus de maladies humaines peuvent être différenciées en cellules d’intérêt pour les tests de médicaments ou l’ingénierie tissulaire, afin de préparer une autre manière la thérapie spécifique au patient avant l’accouchement.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de programmation. Le système de transposon est efficace dans différents types de cellules. Il est plus adapté à l’approche clinique vis-à-vis des vecteurs viraux et permet la production de cellules IPS sans oxyno.

Pour commencer l’isolement, nettoyez la paroi abdominale du barrage avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane, en incisant la longueur de la paroi abdominale pour accéder à la cavité abdominale. Utilisez des pinces pour exposer l’utérus, puis excisez-le à l’aide de ciseaux.

Transférez l’utérus dans une boîte de 100 millimètres remplie de 1xPBS stérile et conservez-la sur de la glace. Placez la parabole sous un stéréomicroscope à un grossissement de 10X et tenez l’utérus avec une pince tout en retirant la paroi utérine avec des ciseaux, en prenant soin de ne pas endommager les membranes fœtales. Rassemblez les fœtus dans un plat de 100 millimètres rempli de 1XPBS stérile et placez-le sur de la glace.

Saisissez le placenta d’un fœtus à l’aide de la pince à pointe fine et déplacez-le dans une parabole propre de 100 millimètres. Ici, retirez soigneusement le sac de jaune. Interrompez l’amniose à l’aide de la pince et à l’aide d’une seringue à insuline, prélevez 30 microlitres de liquide amniotique.

Transférez le liquide dans un flacon conique de 15 millilitres. Répétez ce processus pour chaque fœtus, en recueillant le liquide dans le même flacon à chaque fois. Ensuite, lavez chaque fœtus avec du 1XPBS stérile complété par un pour cent de sérum bovin fœtal et recueillez-le dans le tube conique de 15 millilitres avec le liquide amniotique.

Centrifugez le tube à 145 fois G pendant cinq minutes, puis sous une hotte à flux laminaire, retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules granulées dans deux millilitres de milieu de culture de liquide amniotique. Prenez une plaque à six puits recouverte de gélatine à zéro virgule pour cent contenant des fibroblastes embryonnaires de souris traités à la myomycine-C ou MEF, puis ensemencez deux millilitres de cellules sur la plaque.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et à cinq pour cent de dioxyde de carbone, en changeant de milieu tous les deux jours. Continuez la culture pendant sept jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour la transfection. Pour commencer la transfection, dans un tube de microcentrifugation à un virgule cinq millimètres, mélangez un microgramme de plasmide de transposon avec zéro virgule cinq microgrammes de plasmide d’expression de transposase et zéro virgule cinq microgrammes de plasmide de transactivateur de tétracycline inverse.

Diluer à 100 microlitres à l’aide de d-man. Ajoutez huit microlitres de réactif de transfection dans le tube de microcentrifugation contenant l’ADN. Incuber ce mélange pendant 15 minutes à température ambiante.

En prenant la plaque à six puits avec des cellules AF de souris, ajoutez goutte à goutte 100 microlitres du mélange d’ADN de l’agent de transfection par puits, en distribuant par tourbillonnage doux avec un volume final de deux millilitres par puits. Laissez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le lendemain, retirez le milieu de culture, puis nourrissez chaque puits de cellules avec deux millilitres de milieu frais iPS AF complété par un virgule cinq microgrammes par millilitre de doxycycline pour induire l’expression des facteurs de Yamanaka.

Nourrissez les cellules quotidiennement avec un milieu frais contenant du dox sans passage à partir de ce point. Observez les cellules au microscope fluorescent dans les 24 heures suivant le premier traitement à la doxycylcine pour rechercher toute expression de mCherry et quotidiennement à partir de ce moment pour la formation de colonies. Une fois que la formation des colonies est observée, prélevez des colonies individuelles dans 50 microlitres de milieu de culture cellulaire.

Ensuite, transférez-les séquentiellement dans des puits séparés d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits avec MEF traitée à la mytomycine c. Le lendemain, ajoutez 50 microlitres de trypsine dans chaque puits et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier les colonies en cellules uniques. Après l’incubation, pipeter le liquide de haut en bas pour désagréger davantage les colonies.

Transférez 50 microlitres du mélange de cellules de trypsine dans un nouveau puits contenant du MEF inactivé, puis renvoyez les cellules dans l’incubateur. Lorsque les cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, divisez-les dans un nouveau puits d’une plaque de 24 puits, puis poursuivez l’incubation à température ambiante. Une fois que ces cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, retournez les cellules une à deux dans deux puits, l’un contenant de la doxycycline et l’autre sans pour vérifier que les colonies se développeront également en l’absence de doxycycline.

Continuer à maintenir les colonies IPS AF et le milieu indépendant de la doxycycline sur MEF inactivé à 37 degrés Celsius dans cinq pour cent de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour la coloration, l’imagerie et l’extraction de l’ARN. Ici, les cellules gnomiotiques gliotiques positives de souris pleuripotentes induites par la doxycycline expriment les marqueurs de pleuripotence nécessaires pour confirmer la réussite de la reprogrammation.

L’analyse RTPCR utilisant des cellules R1 ES comme contrôle a montré l’expression des marqueurs de pleuripotence induits en présence ou en absence de doxycycline. L’expression du gène de l’entretien ménager, la bêta-deux microglobuline, a également été observée dans les trois types de cellules. Des tératomes isolés de souris injectées avec les cellules pleuropotentes induites ont été immunomarqués.

La détection de la protéine alpha-fœtale, de l’actine musculaire lisse alpha et de la bêta-trois tubuline dans les masses confirme la différenciation cellulaire en trois couches germinales, l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. De plus, l’analyse RTPCR de corps embryoïdes in vitro et de cellules tératomes in vivo confirme l’expression de gènes marqueurs spécifiques de la couche germinale pour le mésoderme, l’endoderme et l’ectoderme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de reprogrammer les cellules du liquide amniotique murin.

Il s’agit d’une procédure simple et sûre qui peut également être appliquée aux cellules de liquide amniotique humain à partir d’un échantillon obtenu à partir de diagnostics de routine ou de césariennes.