A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

O objetivo geral deste procedimento é isolar com sucesso hepatócitos murinos funcionais para estudar a expressão e secreção de citocinas inflamatórias, como PCR e IL6, em resposta a mediadores da resposta de fase aguda hepática. Este método pode ajudar a responder a questões-chave da função hepatocelular e da contribuição das citocinas hepáticas para um ambiente inflamatório prolongado, como encontrado na doença renal crônica. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma ferramenta robusta para uma análise simples, rápida e reprodutível da metabolômica hepática e da inflamação, bem como uma resposta a drogas.

Para começar, pré-aqueça o meio de perfusão hepática e o meio de digestão hepática em banho-maria a 37 graus Celsius. Configure uma bomba de perfusão conforme mostrado aqui. Em seguida, use o meio de perfusão hepática para pré-encher cuidadosamente o sistema de tubulação da bomba.

Tente evitar bolhas de ar no sistema. Prepare o microscópio estereotáxico para o procedimento de perfusão. Em seguida, após anestesiar um camundongo doador de acordo com o protocolo de texto, coloque o animal anestesiado em uma almofada absorvente.

Use fita adesiva para fixar as extremidades do mouse. Em seguida, barbear e desinfetar o abdômen do mouse. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica com pontas cegas afiadas para realizar uma laparotomia ventral do púbis até a borda cranial do fígado.

Incisar a parede abdominal de ambos os lados em uma posição caudal ao diafragma. Exponha a veia cava inferior ou VCI movendo cuidadosamente o intestino para o lado direito usando cotonetes estéreis. Com tesouras cirúrgicas finas e pontas afiadas, faça incisões laterais no diafragma supra-hepático e abra a cavidade torácica.

Em seguida, use seda cirúrgica 5-0 para ligar a VCI torácica. Com um cateter IV blindado, canule a VCI infrarrenal. Conecte a bomba de perfusão e comece a perfundir o fígado.

Se executado corretamente, o fígado deve começar imediatamente a branquear e inchar. Em seguida, com tesoura cirúrgica fina, transeccionar a veia porta, permitindo a drenagem adequada do sangue e do meio de perfusão. Depois de perfundir o fígado com aproximadamente 30 mililitros de meio de perfusão hepática, pare a bomba de perfusão.

Mude para o meio de digestão do fígado e retome a bomba. Quando a perfusão estiver completa, remova a cânula. Exponha suavemente a região central do fígado e localize o tecido de conexão que liga os lobos do fígado.

Pegue as fibras de conexão centrais e disseque cuidadosamente todos os tecidos que mantêm o fígado no lugar. Em seguida, remova suavemente o fígado. Transfira imediatamente o órgão para um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros contendo 15 mililitros de meio de digestão hepática.

Enquanto trabalha sob uma capa de cultura de células, transfira o fígado do tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros para uma placa de cultura de tecidos estéril. Com uma pinça estéril, rasgue suavemente os quatro lobos do fígado. Se realizado corretamente, o meio de digestão deve se tornar turvo devido ao isolamento de hepatócitos do fígado.

Usando uma ponta de pipeta estéril de 25 mililitros, filtre o meio de digestão turva através de um filtro de células de náilon de 70 micrômetros em um novo tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros para remover partículas de tecido não digeridas e detritos celulares. Centrifugue o filtrado combinado a 50 vezes g em quatro graus Celsius por dois minutos, depois aspire o sobrenadante contendo detritos celulares em excesso e use 25 mililitros de frio 1X William's Medium E para ressuspender suavemente as células. Depois de repetir a filtragem e lavagem dos hepatócitos três vezes, aspirar o sobrenadante para remover o excesso de detritos celulares.

Ressuspenda as células em 25 mililitros de 1X William's Medium E quente que contém suplementos primários de descongelamento e revestimento de hepatócitos e filtre a suspensão através de um novo filtro de células de náilon de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Depois que as células forem contadas, coloque-as em dois mililitros de William Medium E que contém suplementos primários de descongelamento e plaqueamento de hepatócitos em um cluster de cultura de células de seis poços revestido de colágeno. Após duas mudanças de meio para eventualmente matar as células de fome, trate as células com PBS como veículo, 25 nanogramas por mililitro de FGF23, 100 microgramas por mililitro de LPS ou 50 nanogramas por mililitro de IL6 em meio sem soro.

Incubar as culturas por 24 horas. Depois de preparar o RNA usando um kit de coluna giratória de acordo com as instruções do fabricante, adicione 200 nanogramas do RNA isolado a um tubo de PCR. Em seguida, adicione 14 microlitros de água livre de endonuclease e quatro microlitros de transcriptase reversa ao tubo.

Coloque o tubo de PCR no termociclador e execute o seguinte programa de transcrição reversa para gerar cDNA. Para realizar a PCR quantitativa, combine os seguintes componentes da mistura mestre de QPCR em um tubo no gelo. Vórtice a mistura principal.

Em seguida, alíquota de nove microlitros da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione cuidadosamente um microlitro de cDNA em cada poço, preparando três poços para cada amostra. Por fim, execute as amostras em um instrumento de PCR em tempo real e analise os dados de acordo com o protocolo de texto.

Uma imagem representativa de microscopia de luz de células primárias isoladas e cultivadas é representada aqui. A análise imunocitoquímica demonstra que os hepatócitos isolados expressam albumina e o receptor do fator de crescimento de fibroblastos 4. Neste experimento, os hepatócitos isolados primários foram tratados com FGF23, LPS ou IL6 por 24 horas e os níveis de mRNA de PCR e IL6 foram analisados por PCR quantitativo em tempo real.

LPS, IL6 e FGF23 aumentaram significativamente a expressão de PCR e IL6. Como mostrado aqui, os sobrenadantes de cultura de células de hepatócitos primários isolados foram analisados por ELISA para níveis de PCR. Conforme demonstrado com a análise de QPCR, os tratamentos com LPS, IL6 e FGF23 aumentaram significativamente os níveis de PCR nos sobrenadantes celulares quando comparados às células tratadas com PBS.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em apenas algumas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter um ambiente estéril. Devido ao trabalho com cultura primária, minimizar o risco de possível contaminação é mais importante para alcançar os melhores resultados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar com sucesso hepatócitos murinos para estudar várias funções hepatocelulares, como expressão e secreção de citocinas hepáticas.