Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Gli obiettivi generali di questa procedura sono isolare le staminalità che trasferiscono vescicole cellulari extra ed esosomi dalle cellule staminali. E per valutare la capacità di trasferimento della staminalità di queste nano-particelle. Il meso può rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali sul tempo derivato dalle cellule staminali in cellule trans o vescicole.

Oppure l'esosoma può trasferire la proprietà delle cellule staminali a cellule non staminali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule staminali indotte derivano in vescicole transcellulari. E l'esosoma può essere utilizzato per riprogrammare direttamente le cellule non staminali in cellule staminali.

A dimostrare la procedura sarà il ricercatore postale LeMonsier, con l'assistente chirurgico, Pei-Ling, Wen-Tin e Shih-Yin, tutti del mio laboratorio. Iniziare seminando un punto due volte dieci fino alla sesta cellula epiteliale mammaria non aderente/mesenchimale, o NAMECs, in 12 millilitri di terreno per piastra da 15 centimetri per una coltura di quattro giorni in un incubatore per colture cellulari. Il quarto giorno, raccogli il terreno di coltura per la centratura da tavolo.

Quindi trasferire il surnatante in una provetta conica per una seconda centrifugazione da tavolo. Successivamente, trasferire il surnatante in una nuova ultracentrifuga ed eseguire l'ultracentrifugazione per 30 minuti. Al termine della centrifuga, trasferire il surnatante in una nuova provetta da ultracentrifuga e centrifugare nuovamente il surnatante.

Rimuovere il surnatante e risospendere l'esosoma della vescicola extracellulare nel palato PBS per una terza ultracentrifugazione. Quindi, risospendere il palato in PBS fresco e ultracentrifugare le particelle cellulari un'ultima volta. Rimuovere il surnatante e risospendere l'esosoma della vescicola extracellulare del palato in 100 microlitri di PBS.

Quindi, misurare la concentrazione proteica della sospensione della vescicola extracellulare mediante il saggio dell'acido bicinconinnico. La concentrazione dovrebbe essere di circa 20-40 microgrammi per 100 microlitri. Per misurare la concentrazione e le dimensioni delle vescicole extracellulari e degli esosomi, diluire le particelle cellulari a due microgrammi di proteine per 100 millilitri di PBS.

E analizza le particelle mediante l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Per purificare gli esosomi mediante gradiente di densità, dopo la terza ultracentrifugazione, risospendere il palato in due millilitri di iodixanolo al 40% in PBS. E sovrapporre la sospensione cellulare con volumi sequenziali di due millilitri di iodixanolo del 30%, 20%, 10% e cinque percento.

Separare la frazione cellulare mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità utilizzando una pipetta per raccogliere ciascuno dei dieci strati di gradiente alla fine della centrifugazione. Quindi, analizzare la presenza di marcatori esosomiali in ciascuna frazione mediante pagina SDS e western blot secondo i protocolli standard. Utilizzo di anticorpi contro gli appropriati marcatori esosomici di interesse.

Per trattare prima le cellule epiteliali mammarie con le vescicole extracellulari e gli esosomi, seminare due volte la tenda al quinto flusso di cellule epiteliali mammarie luminali basse epcam hi-CD 49F per piastra su piastre a sei pozzetti rivestite di gelatina. Quindi, trattare ogni coltura cellulare con due microgrammi per millilitro di vescicole ed essomi extracellulari derivati da NAMEC. Sostituzione del terreno coltivato con vescicole ed esosomi extra cellulari freschi ogni due giorni per dieci giorni.

Alla fine del periodo di trattamento, posizionare una femmina di topo 57 BL6 anestetizzata di tre settimane in posizione supina e rimuovere il pelo a metà addome. Disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di alcol al 70% e iodio povodone. E praticare un'incisione verticale di cinque centimetri attraverso la pelle, lungo la regione inguinale torassica ventrale.

Esporre alternativamente i cuscinetti adiposi mammari del quarto destro e sinistro. Individuare il linfonodo in ogni cuscinetto adiposo e rimuovere l'intera ghiandola perancama sotto il linfonodo. Successivamente, utilizzare un enzima naturale con attività prodialitica e cologenalitica per staccare le cellule epiteliali mammarie luminali extracellulari vescicali ed essoma trattate.

Neutralizza l'attività enzimatica, con il cinque percento di FBS in PBS dopo dieci minuti. Raccogli le cellule per centrifugazione e scarta il supernatente. Dopo il conteggio, diluire le cellule a una volta dieci al secondo a una volta dieci alla quarta cellula per 15 microlitri di concentrazione di PBS.

E usa una siringa di vetro da 100 litri dotata di un ago calibro 27 per iniettare 15 microlitri di sospensione di cellule epiteliali mammarie in ciascun cuscinetto adiposo. Quindi, chiudere la pelle con clip per ferite. Otto settimane dopo l'iniezione, praticare un'incisione verticale attraverso la pelle dalla regione torassica alla regione insorrinale ed esporre sia il quarto cuscinetto adiposo mammario destro che sinistro.

Rimuovere il quarto glande mammario e distribuire i cuscinetti adiposi su singoli vetrini da microscopio. Quindi, trasferire i vetrini in una cappa chimica e fissare i cuscinetti con fissativi collie per una notte a temperatura ambiente. La mattina successiva, lavare i campioni in 250 millilitri di etanolo al 70% per 15 minuti.

Seguito da 250 millilitri di acqua distillata per cinque minuti. Dopo il lavaggio con acqua distillata, colorare i cuscinetti adiposi con allume carminio per una notte a temperatura ambiente. Seguito da disidratazione in incubazioni ascendenti di etanolo di 15 minuti.

Dopo l'ultima disidratazione, trasferire i campioni in zylene in una cappa chimica fino a quando i cuscinetti adiposi diventano trasparenti. Quindi, montare i vetrini con il mezzo di montaggio e utilizzare uno scanner digitale per vetrini per visualizzare i cuscinetti adiposi a 2.400 punti per pollice. La dimensione delle vescicole isolate e del palato dell'ultracentrifuga è in genere di circa 100 nanometri, misurata mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle.

Inoltre, l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione di frazioni ultracentrifughe di terreno condizionato NAMEC rivela la presenza di abbondanti vescicole di membrana. Dopo la separazione del gradiente di densità, come appena dimostrato, i marcatori esosomiali possono essere rilevati nella frazione iodioxonale al 20%. L'analisi emetrica del lato del flusso di cellule epiteliali mammarie luminali umane scambiate con vescicole ed esosomi extra cellulari di derivazione namica marcati con CFSE rivela un segnale CFSE dieci volte superiore nelle colture trattate con esosomi.

Indicare l'assorbimento specifico di vescicole ed esosomi extracellulari marcati con CFSE, da parte delle cellule epiteliali mammarie. Inoltre, mentre il controllo negativo, le cellule epiteliali mammarie trattate con PBS non mostrano un singolo CFSE, l'evidenza dell'assorbimento extracellulare vescicale ed esosomico di derivazione namica da parte delle cellule trattate con esosoma può essere osservata anche mediante microscopia confocale. In particolare, i cuscinetti adiposi di topi iniettati con cellule epiteliali mammarie luminali epCAMhi/CD49Flo flow sorted trattate con vescicole extracellulari ed esosomi derivati da NAMEC per dieci giorni hanno acquisito la capacità di formare ghiandole mammarie.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnologia ha aperto la strada al nostro ricercatore nel campo della biologia delle cellule staminali. Esplorare l'uso delle cellule staminali derivate da cellule staminali trans e vescicole ed esosomi nella medicina della rigenerazione e nella riprogrammazione cellulare diretta.