Whitefly에서 Endosymbionts의 추출을위한 방법

본 실험의 전반적인 목표는 후속 실험을 위해 아주 작은 곤충으로부터 내생공생균을 추출하는 것입니다. 대부분의 내생공생균은 체외(in vitro)에서 배양이 불가능하므로, 이 방법은 곤충학 및 거시생물학적 관점에서의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 후속 실험을 위해 충분한 양의 박테리아를 분리하는 방법을 제시하는 것은 매우 중요합니다.

이 기술의 주요 장점은 가루이의 세균성 내생공생균을 편리하게 분리할 수 있다는 점입니다. 이는 진딧물, 매미충, 총채벌레와 같은 다른 곤충의 내생공생균 분리에도 적용될 수 있습니다. 먼저, 성체 가루이 한 마리를 채집하여 30 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)에서 균질화합니다.

균질액을 65°C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그 후 100°C에서 10분 동안 배양하십시오. 가루이 DNA와 미토콘드리아 cytochrome oxidase 1 프라이머를 사용하여, 다음 시약을 이용해 25 µL PCR 반응액을 준비하십시오.

그다음, 여기에 제시된 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 수행합니다. 이어서, 권장 프로토콜에 따라 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 그런 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 서열 분석을 수행합니다.

가루이 내 각 내생공생균의 특정 유전자를 증폭하기 위해, 가루이 DNA를 대상으로 PCR을 수행합니다. 이전에 발표된 프로토콜에 따라, 증폭된 샘플을 아가로스 겔 전기영동 및 시퀀싱에 제출하여 가루이 내의 박테리아 종을 결정하고 각 박테리아의 특정 유전자를 식별합니다. 가루이의 박테리오솜을 해부하고 정제하기 위해, 현미경 슬라이드 위에 1x PBS 용액 100 µL를 첨가합니다.

그 다음, 면화 잎에서 3령 또는 4령 약충을 채집합니다. 그리고 이를 PBS에 담급니다. 현미경 하에서 미세 곤충학용 핀을 사용하여 가루이의 몸에서 박테리오솜을 추출합니다.

박테리오좀(bacteriome)은 크기가 작고 취약하므로 분리 시 주의하십시오. 약충의 한쪽에 조심스럽게 구멍을 내고 반대편을 살짝 눌러 박테리오좀이 나오게 합니다. 그런 다음, 0.5-10 µL 피펫에 20 µL 마이크로로더(microloader)를 장착하고, PBS 내의 개별 박테리오좀을 마이크로로더로 추출하십시오.

다른 가루이 조직의 오염을 제거하기 위해 박테리오옴(bacteriome)을 PBS에 넣고 피펫팅하여 추출함으로써 세척합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다. 가능한 한 많은 오염물을 제거하기 위해 세척 과정을 반복하는 것이 매우 권장됩니다.

세척된 박테리오옴을 60 µL의 PBS가 들어 있는 원심 분리 튜브에 즉시 피펫팅하십시오. 조립된 박테리오옴을 5 µm 필터 막으로 시린지 필터링하십시오. 혼합 액체가 막을 통해 완전히 이동하도록 여과 과정을 여러 번 반복하십시오.

여과액을 증폭시키려면, 혈액 또는 세포로부터 게놈 DNA를 증폭하기 위한 권장 프로토콜에 몇 가지 수정 사항을 적용하여 사용할 버퍼 D2를 준비하십시오. 원심분리 튜브에 여과액 1.5 µL를 직접 넣은 후, 버퍼 D2 1.5 µL를 추가하십시오. 잘 혼합하고 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 배양하십시오. 그런 다음 정지 용액 1.5 µL를 추가하십시오.

반응 완충액 15 µL와 DNA 중합효소 1 µL를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 30 °C에서 16시간 동안 배양한 후, 65 °C에서 3분 동안 배양합니다. 박테리아 종을 확인하기 위해 박테리아 전용으로 설계된 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 여과액으로 PCR을 직접 수행합니다.

또한 이전에 발표된 방법에 따라 가루이 유전자인 beta-actin 및 EF1 프라이머를 사용하여 숙주 게놈의 오염 여부를 확인하기 위한 PCR을 수행하십시오. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 메타게놈 시퀀싱을 실시하십시오. 이 그림에서는 가루이 사육용 면화와 가루이의 여러 발달 단계가 표시되어 있습니다.

성충과 1령, 2령, 4령 약충을 포함합니다. MEAM1 4령 약충 내의 내생 공생균인 Portiera와 Hamiltonella에 대한 FISH 분석 결과가 여기에 나타나 있습니다. 두 박테리아의 중첩이 관찰되며, 두 종류 모두 가루이의 bacteriocyte 내에 국한되어 있습니다.

여기 제시된 가루이의 Portiera 내생공생체 투과전자현미경 이미지는 Portiera가 세포벽을 소실했을 가능성을 보여줍니다. 어댑터 및 중복으로 인한 오염 데이터를 시퀀싱하고 정제한 후, 필수 공생체인 Portiera의 전체 게놈을 확보하였습니다. 그 결과 358,232 base pairs의 원형 게놈이 도출되었습니다.

또한, 페어드 엔드(paired end) 관계를 기반으로 89개의 스캐폴드(scaffolds)로 조립된 138개의 컨티그(contigs)를 포함하는 Hamiltonella의 초안 게놈을 확보했습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 20시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 환경 박테리아에 의한 시료 오염이 발생하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 RA 시퀀싱 및 전체 박테리오옴 분석과 같은 추가 분석을 수행하여 내생공생균의 유전자 발현 및 대사와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 곤충학 및 미생물학 분야의 연구자들은 곤충 또는 절지동물 내 내생공생균의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 곤충의 박테리오옴에서 공생균을 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

일부 시약을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.