הערכת בדרכי השתן צומת פגמים חסימה על ידי הזרקת מתילן כחול צבע

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את החסימות של צמתים בדרכי השתן באמצעות הזרקת צבע מתילן לכליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הכליות ודרכי השתן התחתונות, כגון חיבור שלפוחית השתן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה להמחשת מבנה דרכי השתן במקרה הגרוע ביותר התפתחות מסה המאפשרת ניתוח התפתחות דרכי השתן.

כדי להתחיל בניסוי יש למדוד 0.1 גרם של אבקת מתילן כחולה. ממיסים את המתילן הכחול ב -10 מיליליטר של מי מלח 1x פוספט או PBS ומערבלת את התערובת. לאחר מכן סנן את תמיסת המתילן הכחולה של 10 מיליגרם למיליליטר עם מסנן מזרק כדי למנוע סתימה במהלך ההזרקה.

לאחר מכן הרכיבו סט ורידים סטרילי לקרקפת עם מזרק חד פעמי של שלושה מיליליטר ומלאו את המזרק בשלושה מיליליטר של תמיסת מתילן כחולה מסוננת. נקו מספריים ומלקחיים עם 70% אתנול. כדי לאסוף עוברים סביב הלידה ב-E18.5 או E19.5 יש להמית תחילה עכברים בהריון באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני.

לאחר מכן בצע פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות ה-NIH. לאחר מכן ריססו 70% אתנול על פני הבטן הגחונית של החיה. לאחר מכן, בעזרת המספריים והמלקחיים הסטריליים, פתח את חלל הבטן בגחון.

הרם את כל הרחם והפריד אותו מהגוף בקצות קרני הרחם. לאחר מכן שטפו את כל הרחם עם 1x PBS בצלחת פטרי. חותכים את הרחם בצורה מקטעת בעזרת מספריים מנתחים ומסירים את דצידואת השליה בעזרת מלקחיים מנתחים כדי לחשוף את העוברים ושקי החלמון.

הסר תחילה את שק החלמון ולאחר מכן הסר את קרום מי השפיר בעזרת מלקחיים מנתחים כדי לשחרר את העוברים סביב הלידה. ערפו את ראש העובר בעזרת מספריים לניתוח. הצמידו את העובר כלפי מטה עם פני הגחון שלו כלפי מעלה על מיקרוסקופ מנתח המצויד במצלמה דיגיטלית להדמיה.

אסוף את הזנב שלו לגנוטיפ. בעזרת מלקחיים קורעים בזהירות את העור כדי לפתוח את חלל הבטן של העובר. לאחר מכן הסר בזהירות עודפי איברים ורקמות כמו כבד, קיבה ומעיים בעזרת מלקחיים על ידי חיתוך או משיכתם החוצה כדי לחשוף את הכליות, השופכנים ושלפוחית השתן הממוקמים בגב.

ספוג עודפי דם מהעובר המנותח בעזרת רפידות גזה סטריליות ולאחר מכן המשך בהזרקת צבע. הסר בועות במחט ובצינורות על ידי הוצאת תמיסת מתילן כחולה מקצה המחט בלחץ הידרוסטטי. הרם את המזרק המכיל את תמיסת הצבע מעל גובה קצה המחט כדי להתחיל בזרימה.

ואז הורד את המזרק כדי לעצור את הזרימה. לאחר מכן, הכנס את המחט לאגן הכליה ליד השופכן הפרוקסימלי והקפיד לא להפריע לה לאחר הנחתה. בצע הזרקת צבע לכליה כדי לקבוע את חסימת דרכי השתן שלה.

לאחר החדרת מחט אחת לאגן הכליה, לאחר הצלחת בדיקה זו, יש להחדיר מחט לאגן הכליה לכיוון השופכן שאינו עובר דרך הכליה או לכיוון כלי הדם. הרם את המזרק כ-20 סנטימטרים כדי לספק לחץ הידרוסטטי ותן ל-15 עד 16 מיקרוליטר מתמיסת הצבע לזרום. לאחר מכן עקוב אחר הצבע הכחול של הצבע, החל תחילה באגן הכליה, לאחר מכן באורך השופכן ולבסוף בלומן שלפוחית השתן.

הנח את המזרק כלפי מטה כדי לעצור את זרימת הצבע והסר את המחט מהכליה. רשום את ההידרונפרוזיס של הכליה, ההידרואורטר והמיקום הסופי של תמיסת הצבע במחברת מעבדה. לבסוף בצע הזרקה של הכליה הנגדית ואפשר לצבע לזרום במשך 20 שניות בסך הכל.

צלם תמונות של הכליה, השופכן ושלפוחית השתן עם תמיסת צבע באמצעות המצלמה ותוכנת ההדמיה המחוברות למיקרוסקופ סטריאו. לאחר הזרקה לכליה אחת, צבע המתילן הכחול זורם מאגן הכליה דרך השופכן ואל שלפוחית השתן, וכתוצאה מכך צבע כחול גלוי בשופכן ובלומן שלפוחית השתן. כחול חזק יותר מופיע בלומן שלפוחית השתן עקב זרימה ארוכה יותר כ-20 שניות לאחר הזרקת שתי הכליות עם צבע המעיד על היעדר חסימת צומת דרכי השתן במערכת השתן השנייה.

בעת הזרקת הידרואורטר מורחב באופן חריג, המיקום הסופי של תמיסת הצבע אינו ברור. ולא ניתן לאמת חסימת צומת שופכה או UVJO למרות היעדר הצבע בלומן שלפוחית השתן מכיוון שההידרואורטר הלא תקין נפגע באמצע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחשב את שק הצבע של עוברים סביב הלידה כדי לקבל מערכת שתן שלמה.

והסר בועות כדי לא לחסום את זרימת הצבע.