Overview
FM の染料は、プロセスをリサイクル小胞の勉強に重要な使用を発見した蛍光分子のクラスです。化学構造のおかげで、これらの分子はリン脂質二重膜の外側のリーフレットに彼ら自身を挿入できます。膜挿入後貪食胞を介して細胞に取り込ま、ときにこれらの小胞が細胞膜に戻すリサイクルをリリースします。 以来、これらの色素が膜内にある疎水性の環境で強く蛍光を発するし、細胞コンパートメントに弱く、FM 蛍光レベルはリサイクルのプロセスを通して小胞活動の追跡に使用できます。
このビデオは、リサイクル小胞を検討した実験で FM 染料の使用に導入を提供します。生化学 FM 染料およびそのプロパティがこれらの実験での使用を許可する方法を確認しておきます。我々 は、このような研究で FM 染料を使用するための一般的なプロトコルを通過し、最後に、いくつかの最近の研究を論議しなさいこれらのユニークな分子を利用します。
Procedure
FM 色素膜染料リサイクル画像小胞に広く使用されているであります。これは、セルはセル サイズを維持、高価なタンパク質を再利用し、連続して細胞外空間に分子を輸送する独自の膜小胞を形成するプロセスです。このプロセスは、それが神経伝達物質のリリースに関係する神経細胞のシナプスで最も勉強です。小胞のリサイクルを調べるほかクロム親和性細胞と細胞膜修復損傷の分泌など、他のいくつかの現象を研究する FM 染料を使用しています。
このビデオ リサイクル実験勉強小胞で FM 染料の使用に焦点を当てます。私達は刺激されるニューロンのリサイクル プロセスを定量化する FM の染料を使用してステップバイ ステップ プロトコルに行きます。最後に、さまざまな方法でこのユニークな分子を利用したいくつかの例の実験を検討します。
プロシージャにジャンプする前にリサイクル実験小胞での機能を理解する助けになる FM 色素の生化学的性質をまず確認してみましょう。
構造的に、FM 染料はそれらを合成した者から自分の名前を派生スチリル分子-飛毛。これらの染料がある 3 つの主要な構造的特徴: 頭部、尾、そして橋。橋は、それらの間の変数の二重結合領域と 2 つの芳香環で構成されています。このセクション全体では、蛍光体を作成します。
着信によって特定の励起波長の光を襲った、その原子がエネルギーを吸収して励起状態の電子を発生させる任意の蛍光体の性質であります。振動、そして最後に発光波長の光、これらの電子は発光エネルギー、基底状態に戻る。疎水性尾によりパーティションに FM 分子、細胞膜の脂質二重層に、その親水性の頭部は外膜リーフレットに局在化を制限する料金とします。
したがって、それは、細胞に入ることができる唯一の方法は、エンドサイトーシスを介してです。FM 染料が鋭く敏感な環境と極性溶媒が膜のような疎水性の環境で強い蛍光弱い蛍光を示します。これはコントラストの高い膜ラベリングに視覚化できるし、定量化された蛍光顕微鏡を用いて作成します。
これらのプロパティは、評価小胞シナプスでリサイクルに適した FM 染料を作る。簡単に言えば、FM 染付文化をインキュベート プロセスが含まれます。FM 分子のいくつかはその蛍光強度が増大する膜に接続され得る。次に、刺激は膜内面化プロセスを開始します。したがって、いくつかの FM の分子が小胞膜の中に閉じ込め、外側のローカライズされた色素分子の残りの部分は洗い流されます。
2 番目の刺激、内面ステンド グラス小胞の内容を解放する細胞膜と融合し、染料はすぐに departitions、蛍光強度の急激な減少の結果します。蛍光顕微鏡の助けを借りてこの染め色を定量化することができます。
今では FM の色素の生化学的原理に精通しているなら、シナプス小胞は、これらの染料を使用してリサイクルを調べる実験を実行する方法の手順を確認してみましょう。
Coverslips に神経文化の清潔、健康なサンプルは事前に準備されます。これらの細胞は、ラベル付けされる膜を引き起こしている FM 色素溶液に移動されます。サンプル coverslip 顕微鏡のイメージングの商工会議所にマウントされます。
洗浄、液体のような流体の操作入力と出力を許可するには、sealed 灌流チェンバを形成する線が接続されています。蛍光顕微鏡のステージ上に商工会議所をマウントします。商工会議所に配線し電気刺激装置にそれらを接続します。接続されると、刺激および放出フィルターは使用される FM 染料に従って設定されます。
電気刺激を用いた色素を介してエンドサイトーシス小胞への読み込みが誘起されます。刺激後神経終末を回復できます。その後、細胞外の染料はバッファーで洗浄します。これはまた背景の蛍光性を最小限に抑えます。FM 色素が退色は、長期にわたる励起による蛍光強度の弱体化しやすいので励起強度を最小に保つことが重要です。短い潜伏後最初の画像が得られます。次に、開口放出は第 2 の電気信号で誘導されます。
刺激、最後に、異なる時点で蛍光を測定後、すべて脱着可能な染料をアンロードする神経終末を余すところなく刺激できます。その後残りの蛍光は、バック グラウンド蛍光強度として考慮されます。その後、各画像の本質的な蛍光を測定し、画像の非シナプス領域に「関心領域」ツールを使用して。背景の蛍光性と本質的な蛍光性、対時間をプロットし、正規化された蛍光強度を取得する各時点の蛍光強度から減算されます。時間の経過とともに強度の減少を表します染め色、小胞のリサイクルの間接的な指標であります。
今では我々 は、方法論を確認したところ、特定の実験 FM 染料を使用する方法を見てみましょう。
刺激されるニューロンの FM 色素を用いたプロトコルについて話し合った。ここでは、科学者たちは自発的な小胞のリサイクルの勉強に興味があります。彼らは、十分に敏感な蛍光強度の小さな変化を検出する画像処理システムとの組み合わせで確立されたプロトコルを使用してこれをしました。結果は、自発的なシナプス放出が直接の原因は、蛍光強度の減少を表しています。
シナプス前ニューロン内で小胞は 2 つのプールに分かれています: 予備プール、RP、および容易に脱着可能なプールまたは希望小売価格。ここでは、科学者は小胞の人口の各タイプの割合を分析するのに FM 染料を使用しました。強度の電気刺激の連続処理によるこれらの科学者は、小胞プールの各タイプの相対的な割合を定量化することができた。
最後に、細胞生物学者はまた傷ついた膜の exocytic の修復に関与する因子を分析するのに FM 染料を使用します。この実験では、研究者はスフィンゴミエリナーゼ、膜の resealing プロセスでの脂質修飾酵素の役割に特に集中しました。最初に、彼らは細胞の RNA 治療をサイレンシングの助けを借りて酵素スフィンゴミエリナーゼの欠損を生成されます。次に、彼らはこれらの細胞および外因性 FM 色素と細胞膜病変を作成する毒素群を扱われます。最後に、彼らは共焦点の顕微鏡を使用してすべてのサンプルを見る。結果は、スフィンゴミエリナーゼの欠損細胞が細胞内の FM 分子の強固な蓄積を示したことを示した。一方、制御の細胞膜修復におけるスフィンゴミエリネースの役割を示唆して、最小限の FM 流入を示した。
FM 色素胞リサイクルでゼウスのビデオを見てきただけ。ビデオ説明 FM 色素の生化学を汚し、リサイクル、シナプス小胞を定量化のプロトコルの詳細な最後にさまざまな方法でこれらの染料を用いた現在の実験を説明しました。いつも見てくれてありがとう!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
