Impianto degli innesti vascolari elettrofilate con struttura ottimizzata in un modello del ratto

L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è trapiantare un innesto vascolare elettrofilato in un'aorta addominale di ratto e valutare le prestazioni a lungo termine dell'innesto. Questo metodo è stato messo a punto dal professor Deling Kong e da altri colleghi del nostro gruppo e può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio degli innesti vascolari elettrofilati, come l'effetto della struttura e le proprietà superficiali dell'innesto sulla rigenerazione vascolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha una buona ripetibilità e un alto tasso di sopravvivenza degli animali.

Inoltre, il modello animale è facile da gestire a basso costo. Questo lavoro sarà condotto dal nostro collega, il dottor Wang. Per iniziare, preparare la soluzione polimerica sciogliendo il policaprolattone in una miscela da 1 a 5 di metanolo e cloroformio e mescolandola a temperatura ambiente per 12 ore.

Caricare la soluzione polimerica in una siringa di vetro da 10 millilitri e dotarla di un ago smussato calibro 21. Quindi, posizionare un mandrino in acciaio inossidabile sullo strumento di raccolta e assicurarsi che sia adeguatamente messo a terra. Regolare la distanza di lavoro dalla punta dell'ago al raccoglitore a 17 centimetri per la soluzione di policaprolattone al 25%.

Quindi, impostare la portata della pompa a siringa su otto millilitri all'ora. Quindi, impostare la tensione sull'alimentatore a 11 kilovolt e avviare la rotazione del mandrino a 40 giri/min per raccogliere le fibre elettrofilate per un'adeguata distribuzione delle fibre. Con tutto ora pronto, accendi l'alimentatore e la pompa a siringa per iniziare a raccogliere le fibre elettrofilate.

Dopo 4,5 minuti, spegnere la pompa a siringa, l'alimentatore e il motore del mandrino. Lasciare asciugare l'innesto nella cappa per un'ora. Quindi, rimuovere l'innesto dal mandrino utilizzando alcol assoluto e metterlo sotto vuoto per una notte per rimuovere il solvente residuo.

Sterilizzare l'innesto con ossido di etilene e lasciarlo asciugare in una cappa di contenimento biologico sterile. Utilizzando tecniche standard, ottenere immagini SEM del lume degli innesti e importarle in ImageJ. Utilizza gli strumenti di misurazione per misurare sia il diametro della fibra che la dimensione media dei pori in ciascuna immagine, per garantire la coerenza tra i campioni.

Per ottenere informazioni sulle proprietà meccaniche del materiale dell'innesto, tagliare prima un'impalcatura tubolare in sezioni di tre millimetri utilizzando una lama di rasoio. Quindi, utilizzare i calibri per misurare lo spessore dei ponteggi. Quindi, caricare le impalcature nelle impugnature di una macchina per prove di trazione, in modo che ci sia un millimetro tra le impugnature.

Tenere le impalcature assialmente, a una velocità di 10 millimetri al minuto, fino a quando non si rompono. Assicurarsi di registrare sia la resistenza alla trazione che l'allungamento a rottura per i campioni. Prima dell'intervento chirurgico, ratti maschi veloci di Sprague Dawley, di peso compreso tra 240 e 270 grammi, per 24 ore prima dell'intervento di impianto.

Anestetizzare il ratto e prepararlo per l'intervento chirurgico come descritto nel protocollo di testo allegato. Confermare un'adeguata anestesia assicurandosi che il ratto abbia i muscoli rilassati e una respirazione costante. Quindi, posizionare il ratto sotto il microscopio operatorio in posizione supina.

Usando le forbici chirurgiche, eseguire un'incisione laparotomica della linea mediana lunga da quattro a cinque centimetri ed esporre la cavità addominale. Ritrarre con cura e avvolgere l'intestino con una garza inumidita con soluzione salina. Mentre si guarda attraverso il microscopio operatorio, rimuovere l'aorta addominale dai tessuti adiacenti.

Identificare e legare tutti i piccoli rami dell'aorta discendente, utilizzando suture in nylon monofilamento 9-0. Quindi, utilizzare i morsetti vascolari per bloccare fino a una sezione isolata di un centimetro dell'aorta. Quindi, usa un paio di micro forbici per sezionare l'aorta addominale tra i morsetti.

Sciacquare le due estremità dell'aorta utilizzando una soluzione salina eparinizzata per rimuovere il sangue residuo. Staccare l'avventizia dell'aorta bloccata usando le micro forbici. Quindi, posizionare una sezione lunga un centimetro dell'innesto sterilizzato nello spazio creato dalla sezione rimossa dell'aorta.

Utilizzando suture in nylon monofilamento 9-0, costruire quattro anastomosi utilizzando un modello di sutura a forma di otto a ore nove, tre, 12 e poi alle sei del lato prossimale. Quindi, costruisci le altre quattro anastomosi tra ciascuna delle suture sul lato prossimale. Posizionare l'innesto verticalmente per mostrare l'intervallo uguale tra gli otto punti al microscopio operatorio.

Dopo aver terminato la sutura prossimale, ripetere il processo sul lato distale. Una volta che l'innesto è stato attaccato, rimuovere il morsetto distale per consentire al sangue di fluire nell'innesto, quindi rimuovere il morsetto prossimale. Usando un batuffolo di cotone sterile, applicare pressione per fermare qualsiasi sanguinamento osservato nei punti di sutura.

Premere per circa tre minuti, fino a quando non si verifica l'emostasi. Quindi, rimetti l'intestino nella cavità addominale e lava la cavità addominale usando una soluzione salina fisiologica calda contenente gentamicina. Quindi, cucire la parete addominale utilizzando una sutura di nylon 3-0 negli strati muscolari e cutanei.

Utilizzare lo iodio sull'incisione dopo l'intervento chirurgico solo una volta. Restituisci il topo alla compagnia degli altri una volta che si è completamente ripreso. La concentrazione di policaprolattone nella soluzione di elettrofilatura può influenzare sia il diametro della fibra, sia le proprietà meccaniche degli innesti.

La soluzione a concentrazione più elevata al 25% produce innesti vascolari con fibre più spesse e pori più grandi rispetto alla soluzione al 10%. Dopo tre mesi in vivo, la colorazione istologica ha rivelato uno strato di nuovo tessuto formato sul lume dell'innesto e una quantità significativa di deposizione di collagene all'interno dell'innesto stesso. Questo nuovo strato di tessuto è rivestito da cellule endoteliali, al di sotto delle quali si trova uno strato di cellule muscolari lisce e di elastina allineata circonferenzialmente.

Dopo 12 mesi in vivo, il nuovo tessuto appariva ben integrato e gli strati endoteliale e della muscolatura liscia sono rimasti intatti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in una o due ore, se eseguita in modo appropriato. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come l'ecografia color doppler per rispondere a ulteriori domande, come Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare gli innesti vascolari elettrofilati e valutarne le prestazioni in vivo in un modello di sostituzione dell'arteria addominale di ratto.