CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

CARIP-Seq의 전반적인 목표는 게놈 전체의 염색질 관련 RNA를 조사하는 것입니다. ChIP-Seq의 목표는 배아 줄기 세포에서 전 세계적인 규모로 단백질-DNA 상호 작용을 평가하는 것입니다. 이러한 방법은 후성 유전학 및 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하고, 배아 줄기 세포에서 게놈 위치, 전사 인자 또는 후성유전학적 조절 인자 결합 또는 히스톤 변형 점유 또는 염색질 관련 RNA를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이러한 기술의 주요 장점은 염색질 성분과 관련된 RNA의 게놈 전체 편향되지 않은 조사와 단백질 DNA 상호 작용의 전체 식별이 가능하다는 것입니다. 이러한 방법은 배아 줄기 세포 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암 생물학 또는 기타 인간 질병을 연구하기 위해 다른 포유류 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 배아 줄기 세포를 채취하려면 먼저 인산염 완충 식염수로 세포를 씻으십시오.

그런 다음 섭씨 37도로 예열된 0.25% 트립신으로 세포를 분리합니다. 트립신화 후, 10%의 소 태아 혈청이 보충된 예열된 MEF 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 원뿔형 튜브의 세포에 37%포름알데히드를 최종 농도 1%까지 추가하고 섭씨 37도에서 8분 동안 배양하여 세포를 가교합니다.

고정 반응을 중지하려면 섭씨 4도에서 사전 냉각된 1.25몰 글리신을 최종 농도 0.125몰에 추가합니다. 그런 다음 튜브를 회전기에 놓고 실온에서 5분 동안 분당 8회전으로 뒤집습니다. 5분 후 실온에서 5분 동안 300g의 샘플을 원심분리합니다.

원심분리가 끝나면 상층액을 버립니다. 그런 다음 미리 냉각된 인산염 완충 식염수로 펠릿을 세척하고 샘플을 다시 원심분리합니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수를 제거하고 세포를 액체 질소에 1분 동안 동결합니다.

배아 줄기 세포가 얼음에서 해동되면 펠릿을 2.5ml의 초음파 처리 완충액에 재현탁시킵니다. 전사 인자 또는 후성 유전 학적 요인을 연구하려면 sodium dodecyl sulfate없이 초음파 처리 버퍼에 세포 펠렛을 재현탁시킵니다. 히스톤 변형의 경우, 나트륨 도데실 설페이트를 함유 한 완충액에 세포 펠렛을 재현탁시킵니다.

다음으로, 염색질 면역침전을 위해 30초 켜짐 및 30초 휴지 모드에서 40% 진폭에서 14-18회 주기 동안 염색질을 초음파 처리합니다. 단백질 인자 ChIP에 대한 염색질을 용해시키려면 초음파 처리 버퍼에 28 마이크로 리터의 10 % sodium dodecyl sulfate를 보충하십시오. 히스톤 변형의 단백질 인자의 경우 28 마이크로 리터의 나트륨 데 옥시 콜레이트와 0.28 밀리리터의 10 % 트리톤 X-100을 넣고 잘 섞습니다.

다음, 10, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000g에 표본을 전 맑게 하기 위하여 chromatin를 원심 분리하십시오. 1.5 밀리리터의 낮은 결합 튜브에 40 마이크로 리터의 A 또는 G 마그네틱 비드를 추가합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 비드를 세척하고 비드가 있는 튜브를 자석이 들어 있는 랙에 옮기고 실온에서 1분 동안 배양합니다.

그런 다음 인산염 완충 식염수를 제거하고 인산염 완충 식염수 100마이크로리터에 비드를 다시 현탁시킵니다. 튜브에 2-4마이크로그램의 항체를 첨가하고 분당 8회전으로 40분 동안 회전자에 올려 배양하여 비드에 대한 항체 결합을 촉진합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 추가하여 비드를 세척합니다.

세척 후, 초음파 처리된 염색질 추출물을 섭씨 4도의 회전체에서 하룻밤 동안 배양하여 염색질 결합 단백질을 면역침전시킵니다. 다음날 비드를 세척하고 RIPA 완충액, 소금이 함유된 RIPA 완충액, 염화리튬 완충액, Triton X-100이 함유된 Tris-EDTA 완충액 및 Tris-EDTA 완충액으로 각각 10분 동안 회전체에서 배양합니다. ChIP에 대한 비교차결합을 위해서는 100마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액에 비드를 재현탁합니다.

그런 다음 10%sodium dodecyl sulfate 3마이크로리터와 Proteinase K 1ml당 20mg당 20mg씩 5마이크로리터를 추가하고 비드를 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 배양 후 다음날 튜브를 여러 번 뒤집어 마그네틱 랙에 그대로 두고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 0.5 몰 염화나트륨을 함유 한 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 완충액을 첨가하여 자성 비드를 세척하고 두 개의 상층액을 결합하십시오.

CARIP에 대한 비교차결합을 위해서는 100마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액에 비드를 재현탁합니다. 그런 다음 10% 도데실황산나트륨 3마이크로리터와 1밀리리터당 20밀리그램 5마이크로리터의 프로테나제 K를 넣고 비드를 섭씨 65도에서 4-12시간 동안 배양합니다. 다시 튜브를 여러 번 뒤집고 마그네틱 랙에 올려 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 0.5 몰 염화나트륨을 함유 한 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 완충액을 첨가하여 자성 비드를 세척 한 다음 두 개의 상층액을 결합하십시오. 마지막으로, 페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올을 사용하여 RNA 샘플을 25 대 24 대 1 부피 비율로 분리한다. 다음으로, DNase를 사용하여 염색질 관련 면역침전된 RNA 샘플에서 DNA를 제거합니다.

그런 다음 CARIP 샘플에 10X DNase 완충액을 추가하고 최종 부피를 1X 농도로 조정합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 10.5 마이크로리터의 RNA와 1 마이크로리터의 3 마이크로그램 당 무작위 헥사머 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 설정하여 보상 DNA의 첫 번째 가닥을 합성합니다.

2차 구조를 변성시키려면 먼저 섭씨 65도에서 튜브를 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 마스터 믹스를 PCR 튜브에 넣고 섭씨 25도에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 위 첨자 2의 마이크로리터당 200단위의 1마이크로리터를 추가하고 thermocycler 프로그램을 실행합니다.

보상적 DNA의 두 번째 가닥을 합성하려면 시약, 완충액 및 효소를 추가하여 얼음에서 반응을 설정합니다. 그런 다음 와류를 사용하여 시약을 부드럽게 혼합하고 섭씨 16도에서 2시간 동안 배양합니다. DNA가 합성된 후 PCR 정제 키트를 사용하여 보완적인 DNA를 정제합니다.

그런 다음 이중 가닥 DNA를 조각 모음하고 수조 초음파 발생기와 1.5 밀리리터 튜브를 사용하여 DNA를 250-500 염기쌍 크기로 3회 10분 또는 4회 10분 동안 공유합니다. 그런 다음 라이브러리를 준비하고 차세대 염기서열분석을 수행합니다. 여기에서는 줄기 세포 군체를 시각화하기 위해 배아 줄기 세포의 위상차 이미지를 캡처했습니다.

이 프로토콜에서, 세포는 세포의 분화를 방지하기 위해 배양 배지에서 LIF 및/또는 GSK3i와 함께 유사분열적으로 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 존재 또는 부재 상태에서 배양되었습니다. 그런 다음, 가교 결합 배아 줄기 세포 염색질의 초음파 처리 효율을 시각화하기 위해 초음파 처리 된 이중 가닥 DNA를 2 % 아가로 젤에 적재했습니다. 겔 이미지는 200 - 500 염기쌍 범위의 전단된 염색질을 보여줍니다.

다음으로, 배아 줄기 세포에서 히스톤 변형 효소 및 히스톤 변형의 게놈 전체 점유를 평가하기 위해 차세대 염기서열분석 플랫폼을 사용하여 ChIP-Seq 라이브러리를 생성하고 염기서열분석했습니다. 사용자 지정 UCSC 브라우저 보기에서 농축된 H3K4 트리메틸화, H3K4 디메틸화 및 KDM5B는 핵심 다능성 조절 유전자인 POU5F1 및 HOXC 클러스터에서 볼 수 있습니다. 배아 줄기 세포에서 염색질 관련 RNA를 평가하기 위해 CARIP-Seq 분석도 수행했습니다.

사용자 정의 UCSC 브라우저 보기는 배아 줄기 세포에서 H4K20 트리메틸화 관련 RNA 및 H4K20 트리메틸화 점유를 보여줍니다. CARIP-Seq 결과에서 RNA가 H4K20 트리메틸화와 관련이 있지만 특정 유전자 자리와 상호 작용하지 않을 수 있음을 해석할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4일 안에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 CARIP-Seq를 사용하여 염색질 관련 RNA를 조사하고 배아 줄기 세포에서 전 세계 규모로 단백질 DNA 상호 작용을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.