一种微流体方法，用于控制体力生成的信号振荡的功能研究

控制多细胞系统的信号通路是动态的。为了理解这些动力学的功能，必须能够在不影响整体信号活动的情况下巧妙地调节这些动态。该协议使用微流体系统，允许对发育中的小鼠胚胎中的信号振荡进行功能性解剖。

在包括成人组织在内的许多组织中已经发现了信号传导动力学。微流体是一种多功能工具，可以适应许多模型系统，包括细胞，组织和类器官培养。首先，通过将单体与催化剂以九比一的比例混合来制备所需量的PDMS以诱导聚合。

使用一次性工具，确保正确混合。将PDMS混合物置于干燥器中，真空约30分钟以除去空气。将大约3到5毫米的PDMS层倒入芯片模具中，然后放回干燥器中约30分钟。

根据模具材料，将模具放入65摄氏度或更低的烤箱中过夜，以固化模具。使用手术刀将芯片从模具中切出。从微流体室内部开始，使用一毫米活检冲头打孔入口和出口孔。

用压缩空气清洁载玻片。要将芯片粘合到载玻片上，请将芯片和载玻片放入等离子烤箱中，其两侧正面朝上。使用特定于所用机器的协议生成等离子体，然后通过将激活的表面相互放置并均匀施加压力，将芯片粘合到玻璃上。

为了准备用于实验的管子和切屑，请以45度角切割卡套管，并将一根针连接到每个管子上。将带有针头，芯片和插头的管子放入培养皿中，并通过暴露在紫外线下约15分钟对其进行消毒。要用纤连蛋白涂覆芯片，请将芯片置于室温下含有PBS加1%青霉素或链霉素的烧杯中。

用PBS冲洗芯片，用P200移液器除去空气。为芯片的每个腔室装入三毫升注射器。将针头连接到含有纤连蛋白的注射器上，并将注射器连接到注射器泵。

手动冲洗管道以排出空气。将出口管连接到芯片的出口。确保将卡套管一直推到底部，并设置低流速以涂覆芯片。

让注射泵运行至少两个小时或过夜。完成后，停止泵并在针头后立即切断管道。准备充满实验培养基的注射器，并在PBS中对培养基和芯片进行脱气。

尝试冲洗或吸走芯片中的大部分气泡，然后在泵中安装注射器并将进气管连接到注射器上。要将组织装载到芯片上，请解剖尾巴的最后端。用25微摩尔HEPES培养基冲洗芯片以除去PBS。

使用P200移液器将组织装入芯片中。在每个组织加载步骤之后，使用一块PDMS填充的管子关闭相应的组织加载入口。要组装微流体装置，请将管子连接到微流体芯片上，而不会在内部产生气泡。

为此，请确保在管道末端有一滴介质。一旦所有管子都连接到芯片上，将其从烧杯中取出，并将其放入装有湿纸巾的培养皿中。将培养皿和约1.5米的入口管放入培养箱中过夜培养。

确保高湿度，以防止在培养过程中形成气泡。或者，干燥芯片的外部并将其置于显微镜支架中，然后将支架和约1.5米的入口管放入倒置显微镜的孵育室中进行实时成像实验。在至少20分钟的恒定流量后，开始计划泵送实验。

为了在分段小鼠胚胎中夹带缺口信号传导，使用100分钟培养基和30分钟药物脉冲的泵送程序重复直到实验结束，通常持续24小时。对于实时成像，请在至少 30 分钟后开始成像。为了确认信号振荡的夹带，使用药物脉冲的时间对齐多个实验，并使用Cascade Blue染料可视化。

量化振荡可以去趋势化，并显示为可以计算振荡的均值和标准偏差或相位。可以分析独立后胚胎培养物相互振荡以及与外部药物脉冲之间的相位关系。为了确认夹带，例如，可以使用基于Python的程序pyBOAT确定内源性信号振荡的周期。

当应用周期为130分钟的脉冲时，陷波信号振荡也显示130分钟。在微流体实验过程中防止液体蒸发至关重要。否则，芯片中会形成气泡，干扰介质流动。

为防止这种情况，请对培养基和芯片进行脱气，并确保培养箱中的湿度足够高。使用这种方法，可以通过荧光报告基因的实时成像，免疫染色或原位杂交来调节信号动力学并分析其效果。此外，还可以从芯片中提取组织以进行进一步分析。

人们可以使用这种方法来研究胚胎发育中信号振荡的功能。它用于证明两个振荡信号通路之间的相移对于小鼠胚胎分割的重要性。更一般地说，它现在可用于剖析多细胞系统中动态信号编码的机制。