Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN
A coleta de sangue é um requisito comum para estudos de pesquisa que envolvem ratos e ratos. O método de retirada de sangue em camundongos e ratos depende do volume de sangue necessário, da frequência da amostragem, do estado de saúde do animal a ser sangrado e do nível de habilidade do técnico. 1 Todos os métodos discutidos-retro-orbital sinus sangram, sangramentos iniciais de corte de cauda e sangramentos intracardiac – requerem o uso de uma anestesia geral.
Antes do procedimento de sangramento, o tipo de amostra necessária deve ser determinado. Procedimentos experimentais podem exigir sangue inteiro, plasma ou soro. Para o sangue inteiro, um anticoagulante deve ser adicionado à amostra. O plasma, que contém fibrinogênio e outros fatores de coagulação quando separados dos glóbulos vermelhos, pode ser extraído de uma amostra anticoagulada. O soro é obtido através da coleta de sangue sem um anticoagulante. O soro resultará da centrifugação da amostra uma vez que um coágulo tenha se formado. Como a amostra coagula, o soro não conterá fibrinogênio ou outros fatores de coagulação. Tanto o plasma quanto o soro são obtidos através do uso de uma centrífuga a 2200-2500 RPM por um mínimo de 15 minutos.
Para uma amostra que deve produzir sangue inteiro ou plasma, deve-se usar um anticoagulante apropriado. Anticoagulantes comumente usados para animais de laboratório são heparina, citrato de sódio e ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA); seleção da qual é baseada em necessidades de pesquisa. Sequester-uma forma líquida de EDTA, heparina e citrato de sódio pode ser carregado diretamente na seringa para revestir as superfícies. Isso permite o contato do anticoagulante diretamente à medida que o sangue é extraído, auxiliando na prevenção da coagulação. Como o sangue de rato coagula mais rápido do que a maioria do sangue mamífero, é essencial que a razão correta de anticoagulante para sangue seja usada para coleta de sangue.
A seleção da agulha é baseada no tamanho do animal e no local da venipunctura. Em geral, quanto maior o furo da agulha, mais rapidamente a amostra pode ser coletada. Menos danos às células sanguíneas é outro benefício para agulhas maiores. No entanto, a principal desvantagem para agulhas de grande porte é o dano potencial ao vaso. Em camundongos e ratos, as opções de tamanho variam de agulhas de calibre 20-29 que têm 0,5-1,5 polegadas de comprimento. Se uma agulha é muito longa, não só é estranho usar, mas ter o espaço extra na agulha pode resultar em coagulação. O tamanho adequado da agulha está listado para cada método na seção de procedimentos.
O tamanho da amostra necessária também deve ser predeterminado. Devido ao pequeno tamanho do rato ou rato, a quantidade máxima de coleta de sangue deve ser calculada para um sangramento de sobrevivência. Um rato médio pesando 25 gramas tem um volume sanguíneo total de 1,8 ml; o rato médio pesando 250 gramas tem um volume sanguíneo total de 16 ml. Para uma única amostra de sangue em um rato ou rato sem substituição de fluido, o volume máximo de sangue que pode ser removido com segurança é de 10% do volume sanguíneo total, ou 7,7-8 μl/g. Assim, para um rato médio, 10% do seu volume sanguíneo é de 193-200 μl. Para um rato médio de 250 gramas, isso equivale a 1,9-2,0 ml. Estudos mostraram que remover mais de 15% do volume sanguíneo pode causar choque hipovolêmico. 1,2 No entanto, com a substituição do fluido, até 15% do volume total do sangue ou 12 μl/g-podem ser removidos. Para um mouse de 25 gramas, isso equivale a 300 μl; para um rato de 250 gramas, é equivalente a 3 ml. Para a substituição do fluido, os fluidos devem ser aquecidos e dados subcutâneamente.
Se for necessário colher várias amostras, o volume sanguíneo extraído é reduzido. O volume máximo de sangue que pode ser extraído por semana não é superior a 7,5% do volume sanguíneo total, ou 6 μl/g. Para um mouse de 25 gramas, isso equivale a 145-150 μl por semana. Para um rato de 250 gramas, isso equivale a 1,45-1,50 ml por semana. Se a amostragem ocorrer a cada 2 semanas, até 10% do volume sanguíneo total (8 μl/g) poderá ser sorteado. Isso equivale a 200 μl a cada 2 semanas para um rato médio, e até 2,00 ml a cada 2 semanas para um rato de 250 gramas. Um estudo, realizado em ratos com o peso médio de 250 gramas, revelou que quando os volumes sanguíneos de 15-20% foram removidos, levou mais de 29 dias para que os níveis sanguíneos se normalizassem. 1,2 Para a coleta de sangue repetida, a substituição do fluido não permite um maior volume sanguíneo ou coleta de sangue mais frequente, pois substitui apenas o volume. O animal precisará de tempo para repor as células sanguíneas.
O uso do plexo retro-orbital tem sido uma prática comum no passado. No entanto, muitas preocupações sobre a humanidade desse procedimento surgiram. Durante o procedimento, o movimento excessivo do tubo hematócrito uma vez colocado no canthus medial do olho pode causar danos aos tecidos circundantes, resultando em inchaço das pálpebras e/ou membranas conjuntivistas. Os tecidos inchados podem fazer com que o globo ocular se projeta o suficiente para que o fechamento da pálpebra seja impedido, resultando potencialmente em secagem e danos na córnea. Dor do inchaço pode desencadear arranhões e automutilação que resulta em enucleação do olho. A colocação inadequada do tubo hematócrito durante uma hemorragia retro-orbital pode cortar o nervo óptico, resultando em cegueira. Se o tubo hematócrito for avançado em um ângulo impróprio, o olho pode ser forçado a sair da órbita, permitindo que as pálpebras caiam atrás do globo ocular. Se isso ocorrer, é muito difícil substituir corretamente o olho na tomada. Outras questões que podem surgir incluem fratura dos frágeis ossos da órbita, penetração do globo ocular que resulta na perda de humor vítreo, ou a formação de um hematoma atrás do olho que pode resultar em dor extrema devido à pressão no olho e estruturas circundantes. Apesar de todas essas preocupações, se um técnico qualificado realiza o procedimento e o animal é totalmente anestesiado com um anestésico geral, como a anestesia ininhante isoflurane, o sangramento retro-orbital tem se mostrado um método eficaz de coleta de sangue em roedores.
A estrutura anatômica da área orbital é diferente entre o rato e o rato. O rato tem o sinuso retro-orbital- uma coleção de vasos que criam um seio na área orbital. Na órbita do olho de rato, há um plexo de vasos que fluem atrás desse olho; no entanto, eles não formam um seio, como no rato. Consequentemente, é mais fácil realizar este procedimento em camundongos. Para a coleta de amostragem repetida através do plexo retro-orbital, é necessário um mínimo de 10 dias entre os sangramentos para permitir que os tecidos da área se curem. Embora a anestesia geral seja recomendada, o procedimento pode ser realizado em camundongos sem anestesia geral se um anestésico oftalmológico tópico, como proparaca ou tetracaína, for aplicado antes do procedimento. Como os ratos não têm o seio retro-orbital, e como suas membranas ao redor da órbita são muito mais fortes, é obrigatório anestesiar-los para este procedimento.
Amostras seriais de um pequeno volume podem ser obtidas usando um método de clipe de cauda. A amputação inicial da cauda deve ser limitada a uma ponta traseira, aproximadamente 0,5-1,0 mm de comprimento em camundongos e 2,0 mm em ratos. 1 O procedimento de corte de cauda para coleta de sangue permite coletas em série interrompendo a cicatriz ou coágulo do corte original na extremidade da cauda. Geralmente, não é necessária amputação adicional da ponta da cauda. Os volumes de sangue coletados variam de 20-100 μL para camundongos e 75-150 μL para ratos. A quantidade coletada é variável entre os animais e pode ser influenciada pela idade, estado de saúde e peso.
A amostra coletada de um corte de cauda pode conter sangue arterial e venoso, juntamente com contaminação do produto tecidual. A qualidade da amostra diminui se a cauda for acariciada ou “ordenhada” para obter mais sangue. Para aumentar o fluxo sanguíneo, a cauda pode ser aquecida com compressas quentes, uma lâmpada de calor ou submersão em água morna. A pressão deve ser aplicada na ponta da cauda para hemostasia, e os animais devem ser verificados a cada 5-10 minutos para garantir que a hemostasia tenha sido alcançada. A hemostasia é frequentemente retardada com amostragem repetida. Um pó esticado pode ser usado para hemostasia. Para a amputação inicial, recomenda-se anestesia (geral ou local). O sangramento subsequente não deve exigir anestesia, especialmente porque os animais se habituam ao procedimento. A anestesia causará uma queda na pressão arterial, dificultando a coleta de sangue com essa técnica.
Uma alternativa para um corte de cauda é o corte do vaso de cauda. Este procedimento é facilmente realizado em camundongos e ratos. No entanto, como com o corte da cauda, as amostras podem estar contaminadas com produtos tecidos, especialmente no camundongo. Para ratos, uma agulha hipodérmica é inserida no vaso, e o sangue é coletado do centro da agulha. Um estudo demonstrou o uso de um torniquete colocado acima do local de punção da agulha para auxiliar na coleta de sangue. 3 Uma seringa não é usada para tirar o sangue do vaso, pois a pressão criada a partir da seringa vai colapsar o vaso. Este método também pode ser usado para amostragem serial, pois um coágulo pode ser removido para fazer com que o local sangre novamente. Assim como nos cortes de cauda, é imprescindível garantir a hemostasia aplicando pressão no local e rechecando o animal a cada 5-10 minutos.
Muitas vezes, os estudos requerem uma amostra de sangue não-sutaracival, grande que é coletada através de exsanguinação através de um sangramento intracardiac ou da veia cava caudal. 4 Aproximadamente metade do volume sanguíneo total pode ser coletado de um rato ou rato por punção cardíaca. Isso equivale a 40 μl/g ou aproximadamente 1 ml para um mouse médio de 25 gramas. Um rato de 250 gramas produziria aproximadamente 10 ml de sangue. O animal deve ser anestesiado para exsanguinação. A anestesia inalante ou narcoseco2 pode ser usada por um técnico proficiente; anestesia injetável também pode ser usada. No entanto, pode haver uma diminuição da pressão arterial e da circulação, o que pode diminuir a quantidade de sangue coletada.
O método caudal vena cava exige que o animal seja profundamente anestesiado para expor cirurgicamente o vaso. A narcose co2 não é suficiente, pois o coração deve estar batendo e o animal respirando durante a retirada de sangue. Durante o procedimento, a retirada muito rápida do sangue pode fazer com que o vaso entre em colapso no chanfrado da seringa, ocluindo a abertura e impedindo a coleta de sangue. Além disso, as paredes do vaso são finas e, portanto, o movimento da mão e da agulha deve ser evitado para evitar ruptura ou vazamento de sangue do local de entrada da agulha. Como a agulha não está passando pela pele, este método resulta na coleta de uma amostra estéril. Métodos aditivos de eutanásia devem ser empregados para garantir que o animal não se recupere da anestesia. Este método é frequentemente seguido por perfusão cardíaca ou aórtica.
O método intracardiac pode ser realizado tanto com o animal contido manualmente uma vez que é anestesiado (método fechado), ou o coração pode ser exposto cirurgicamente de acordo com o protocolo para o método de coleta de sangue vena cava caudal (método aberto). Para o método fechado, os marcos para colocação da agulha são o sulco formado pela caixa torácica no processo xifoide, no lado esquerdo do animal.
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
