アミロイドペプチドに適用される変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋
Summary
変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋は、準安定タンパク質混合物のオリゴマーのサイズ分布の特性評価が可能になります。とアミロイドβ-蛋白質、およびカルシトニンの42残基のフォーム、およびコントロールペプチド成長ホルモン放出因子 – 私たちは、3つの代表的なアミロイドペプチド40にPICUPのアプリケーションを示しています。
Abstract
毒性オリゴマーへのアミロイド蛋白質のアセンブリは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、遺伝性の筋萎縮性側索硬化症、および2型糖尿病を含むタンパク質のミスフォールディング病の病因に重要な出来事です。これらのタンパク質のアセンブリの準安定な性質のおかげで、それはそのような電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、または動的光散乱などの古典的な方法を用いて定量的にそのオリゴマーのサイズ分布を評価するのは困難である。アミロイド蛋白質のオリゴマーはオリゴマーがモノマーに解離すると同時に、大きなアセンブリに関連付けるれる準安定混合物として存在している。 PICUPは共有結合架橋やドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS – PAGE）やサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）などの分画法と組み合わせた場合、PICUPがクロスする前に存在したオリゴマーのサイズ分布のスナップショットを提供することによりオリゴマーの個体数を安定化 – リンク。したがって、PICUPは準安定タンパク質集団の可視化と定量分析を可能にし、シーケンスの変更とオリゴマー化の間に組み立てと解読の関係を監視するために使用することができます。<sup> 1</sup>。機構的に、PICUPは、Ruの光酸化を含む<sup> 2 +</sup>トリス（ビピリジル）ルテニウム（II）錯体（RuBpy）のRuに<sup> 3 +</sup電子受容体の存在下で可視光照射による>。 RU<sup> 3 +</sup>ラジカルタンパク質を生成し、隣接するタンパク質の分子から電子を抽象化することのできる強力な一電子酸化剤です。<sup> 1,2</sup>。ラジカルは不安定な、非常に反応性種であり、したがって、内と分子間反応のさまざまな急速に消える。ラジカルは、その後、水素原子を失い、安定した、共有結合している二量体を形成する二量体のラジカルを形成する別のタンパク質の単量体と反応する不対電子の高エネルギーを利用することができる。二量体は、次に高次のオリゴマーを形成する単量体または他の二量体と同様の機構を介してさらに反応する可能性があります。その他の写真または化学的方法で架橋相対PICUPの利点<sup> 3,4</sup>短い（≤1秒）の非破壊可視光への曝露、不要に含まれています<i>事前に事実上の</i>ネイティブ配列の改変、および長さゼロの共有結合架橋。さらに、PICUPは生理的パラメータを含む、広いpHおよび温度範囲内のタンパク質の架橋を可能にします。ここで、我々は3つのアミロイド蛋白質40の架橋にPICUPのアプリケーションを示す – と42残基のアミロイドβ-タンパク質変異体（Aβ40およびAβ42）、及びカルシトニン、および制御のタンパク質、成長ホルモン放出因子（GRF）。
Protocol
Discussion
PICUPは、安定したタンパク質複合体2を研究するためにもともと開発されました。メソッドは、Aβ10、プリオンと疾患関連PrP Scが11、およびα-シヌクレイン12を含む準安定アミロイドタンパク質の集合体の定量的研究、に後から適用されました。 PICUPの実験を設計する際に考慮しなければならない最も重要な要因は、試薬の化学量論、照射時間、及び試料調製の手順で?…
Acknowledgements
この作品は、公衆衛生のカリフォルニア部からラリーL. Hillblomアルツハイマー病協会から財団、IIRG – 07から58334まで、および07から65798からNIH / NIA、2005/2Eからの補助金AG027818とAG030709によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Outro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Outro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Outro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Outro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Referências
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