Foto-Induced bryggbindningen av Oförändrad Proteiner (picup) Tillämpat på Amyloidogenic Peptides
Summary
Foto-inducerad bryggbindningen av omodifierade proteiner (picup) tillåter karakterisering av oligomerer storleksfördelningen i metastabila protein blandningar. Vi visar tillämpning av picup till tre representativa amyloidogenic peptider i 40 – och 42-rester former av amyloid β-protein, och kalcitonin, och en kontroll peptid tillväxt-hormone releasing faktor.
Abstract
Montering av amyloidogenic proteiner i toxiska oligomerer är en banbrytande händelse i patogenesen av sjukdomar proteiners ansamling, bland annat Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar, ärftliga amyotrofisk lateralskleros, och typ 2 diabetes. På grund av den metastabila naturen hos dessa proteiner församlingar, är det svårt att bedöma deras fördelning oligomerer storlek kvantitativt med hjälp av klassiska metoder, såsom elektrofores, kromatografi, fluorescens, eller dynamisk ljusspridning. Oligomerer av amyloidogenic proteiner existera som metastable blandningar, där oligomerer sönderfalla i monomerer och koppla till större enheter samtidigt. Picup stabiliserar oligomerer populationer av kovalenta tvärbindning och i kombination med fraktionering metoder, såsom natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) eller storlek uteslutning kromatografi (SEC), ger picup ögonblicksbilder av de distributioner oligomer storlek som fanns innan korset -länkning. Därför gör picup visualisering och kvantitativ analys av metastabila protein populationer och kan användas för att övervaka montering och tolka relationer mellan sekvens ändringar och oligomerisering<sup> 1</sup>. Mekaniskt innebär picup foto-oxidation av Ru<sup> 2 +</sup> I en tris (bipyridyl) Ru (II) komplex (RuBpy) till Ru<sup> 3 +</sup> Genom bestrålning med synligt ljus i närvaro av en elektronacceptor. Ru<sup> 3 +</sup> Är en stark en-elektron oxidationsmedel som kan abstrahera en elektron från en närliggande proteinmolekyl, som genererar ett protein radikal<sup> 1,2</sup>. Radikaler är instabila, högt reaktiva ämnen och därför försvinner snabbt genom en rad olika intra-och intermolekylära reaktioner. En radikal kan utnyttja den höga energin i en oparade elektron att reagera med annat protein monomer bildar en dimeriskt radikal, som sedan förlorar en väteatom och bildar en stabil, kovalent kopplade dimer. Den dimer kan sedan reagera vidare genom en liknande mekanism med monomerer eller andra dimerer att bilda högre ordningens oligomerer. Fördelar med picup förhållande till andra foto-eller kemisk tvärbindning metoder<sup> 3,4</sup> Innehålla korta (≤ 1 s) exponering för icke-destruktiva synligt ljus, inget behov av<i> Pre facto</i> Modifiering av infödda sekvensen, och noll-längd kovalenta förnätning. Dessutom möjliggör picup bryggbindningen av proteiner inom vida pH och temperaturområden, inklusive fysiologiska parametrar. Här visar vi tillämpa picup till tvärbindning av tre amyloidogenic proteiner på 40 – och 42-rester amyloid β-protein varianter (Aβ40 och Aβ42) och kalcitonin, och en kontroll protein, tillväxt-hormone releasing faktor (GRF).
Protocol
Discussion
Picup utvecklades ursprungligen för att studera stabila proteinkomplex 2. Metoden tillämpades senare kvantitativ studie av metastabila församlingar amyloid protein, inklusive A-beta-10, prioner och sjukdom-associerade PrP Sc 11 och α-synuklein 12. De viktigaste faktorerna som måste beaktas när man utformar en picup experiment är reagensen stökiometri, bestrålning tid och provberedning förfarande. De två första frågorna kan kräva empiriska optimering, medan den senare frågan i hög g…
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag AG027818 och AG030709 från NIH / NIA, 2005/2E från Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58.334 från Alzheimers Association, och 07-65.798 från Kalifornien Institutionen för folkhälsovetenskap.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Outro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Outro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Outro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Outro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Referências
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
