一个神经元和星形胶质细胞共培养检测神经毒性的高含量分析

Summary

本文介绍了一种新的协议和试剂，为敏感的神经毒性作用的化合物和治疗联合培养的神经元和星形胶质细胞使用高含量的分析测量设计。结果表明，高含量的分析，代表着一个令人兴奋的新技术，神经毒性评估。

Abstract

高含量的分析（HCA）的分析相结合细胞自动成像和强大的图像分析算法和检测试剂，允许在一个单一的检测多个细胞表型的测量。在这项研究中，我们利用HCA的发展为神经毒性的新的分析。神经毒性评估的药物安全性评价的重要组成部分，以及作为一个环保工作的重要重点。此外，神经也是一个广为接受的的<em>在体外</em>标记的神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏病的发展。最近据报道，HCA的神经元的筛查中的应用。 HCA的检测标签βIII-微管蛋白的神经细胞，可以提供高通量，非主观的神经元的数量，神经轴突计数和突起的长度，所有这些都表明神经毒性作用，如参数的定量测量。然而，星形胶质细胞的作用仍然未开发的，在这些车型。星形胶质细胞具有不可或缺的作用，在维护中枢神经系统（CNS）的动态平衡，当他们在应对有毒物质或疾病状态激活的神经保护作用和neurodegradation关联。 GFAP的是一种中间丝蛋白，主要表达在中枢神经系统的星形胶质细胞。星形胶质细胞的活化（胶质细胞增生），GFAP的表达上调，通常伴有星形胶质细胞增生和肥大。这种反应性胶质化的过程中已经提出的神经系统造成损害的早期标志。 GFAP的定量分析的传统方法是通过免疫分析。这种方法无法提供信息，对细胞定位，形态和细胞数量是有限的。我们确定，HCA可以用来克服这些限制，并同时测量多个与胶质细胞增生相关的功能 – GFAP表达的变化，星形胶质细胞肥大，和星形胶质细胞的增殖 – 在一个单一的检测。在共同的文化研究，星形胶质细胞已被证明，以防止有毒侮辱的几种类型的神经元和批判性的影响神经元的存活。最近的研究表明，在使用的星形胶质细胞<em>在体外</em>神经毒性测试系统可能证明比单独的神经细胞对人体的中枢神经系统的结构和功能。因此，我们已经开发出神经元和星形胶质细胞共培养HCA的检测，包括协议和验证，目标具体分析βIII-微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）检测试剂。此实验可同时分析神经轴突生长，神经胶质增生，神经元和星形胶质细胞的形态和在多种细胞模型的神经元和星形胶质细胞的发展，一种新型的，非主观的，高通量检测神经毒性评估。该试剂盒拥有增强检测神经毒性和神经科学的研究和药物发现提高生产力的巨大潜力。

Protocol

细胞制备： 直到〜70％至80％融合（细胞检测，文化生长介质中的星形胶质细胞神经​​元/播种前，除非细胞从解冻或隔离直接播种）。 通过方法适合于细胞类型的兴趣分离细胞培养瓶/板。如果有必要，大衣检测井盘与D -聚赖氨酸或细胞外基质蛋白，增强细胞的粘附。联合培养的星形胶质细胞和神经元可能同时或顺序号种子。对于连续的种子队，电镀的第一层作为“基础”的星形胶质细胞是建议，由神经元的电镀和分化，如有必要。细胞类型，随后的培养时间，感兴趣的参数进行适当调整细胞密度等，根据文化，年龄，细胞来源和播种密度，小学文化的差异很大，GFAP表达或突起生长增殖率 – 是很重要的表征和优化您的电池系统，提供为您的实验模型中大多数生物的相关性，以及提供有效的成像，分割和使用的HCS（见图1）分析。加入细胞板（种子细胞可能在90μL的媒体，以促进毒素治疗，在下面的步骤3中所述）后，使板在室温下在水平表面上坐15-30分钟，使即使是细胞分布。在此期间，孵育细胞生长介质中至少24小时（37 ° C / 5％的CO 2），然后切换到分化培养条件下（例如，低血清/ NGF对PC12细胞），适当的。继续文化，直到细胞达到所需的合流或分化水平，改变在适当的时间间隔为细胞类型的媒体。 细胞治疗（控制化合物，测试化合物等）可在任何时候，这种文化期间，利息的处理时间，当然适当。丙烯酰胺，双氧水和K – 252A是作为神经毒性控制化合物。提供了充足的试剂是重复的12点的剂量反应曲线（包括一个 生署2 O或DMSO控制范围内设定的剂量反应）所有五个96孔板。该化合物是提供250X的浓度（K – 252A，假设为1μm的最大处理）或10X（丙烯酰胺和过氧化氢，假设分别为100毫米和10毫米，最大的治疗）。推荐的治疗准备工作涉及半的日志（1：√10）连续稀释250X化合物在DMSO，复方稀释液稀释10X（10X控制卫生署2的化合物可能会连续稀释后，直接在无菌的dh 2 O或复方稀释液）。每次治疗10μL，然后可能被加入到90μL，每口井已经存在的文化传媒，作最后的1X浓度（0.4％DMSO或10％DH 2 O ）。样本数据是在37 ° C之前，以固定为24或96小时复方治疗。 细胞固定和免疫荧光染色： 注：染色时间约2.5小时后固定。不要让井干染色步骤之间。试剂的愿望和豁免应进行低流速，以减少由于流体剪切任何细胞的损失 。 所有建议“是指每以及”卷单井的96孔微孔板。所有“建议每96孔板”卷包括液体处理量损失超过25％。所有的染色步骤是在室温（RT） 。所有缓冲区和抗体的解决方案是稳定的，在室温下至少24小时。 在文化时期的结束，预温HCS固定的解决方案（2X）室温（RT）或37 ° C，如果需要的话（12 mL/96-well板）。在化学通风柜，加入100μL/孔直接向文化传媒，并允许在室温下30分钟的修复。删除固定液/毒素包含媒体，并在符合危险废物的规定处置（见MSDS）。如果立即着手染色，冲洗两次，每孔200μL的HCS免疫缓冲区。另外，如果板沾在稍后的时间，冲洗两次与200μL洗涤缓冲液，然后离开井和存储板，紧紧密封在4 º C，直到染色第二次冲洗量。 如果固定样本已储存在4℃染色前，200μL的HCS免疫缓冲区冲洗两次，然后进行染色协议。 准备工作βIII兔抗微管蛋白/鼠标抗GFAP HCS（6 mL/96-well板）主要抗体的解决方案如下：每个解冻的抗体加入60微升至5.88毫升的HCS免疫缓冲区。拌匀。删除以前的免疫缓冲液冲洗。加入50μL小学抗体溶液到每口井和1小时在室温下孵育。 删除第一抗体解决方案。用200μLHCS免疫缓冲区冲洗三次。 准备工作的HCS中抗体/赫斯特的HCS核染色（6 mL/96-well板）的解决方案如下：每个解冻二级抗体加入30μL和30μL解冻赫斯特的HCS核染色5.91毫升的HCS免疫缓冲区。拌匀，由轻保护的解决方案。删除以前的HCS免疫缓冲区冲洗。加入50μL的HCS中抗体/赫斯特的HCS核染色溶液，孵育1小时，在避光RT。 删除的HCS中学抗体/赫斯特HCS核染色解决方案。用200μLHCS免疫缓冲液冲洗两次。 删除以前的HCS免疫缓冲区冲洗。用200μL的HCS洗涤缓冲液冲洗两次，留下第二次冲洗量在井。 立即密封板和形象，或存放在4℃板避光，直到成像准备。 图像采集和分析： 染色板的成像和分析，可能是各种可用的HCS平台，包括细胞分析仪（通用电气医疗集团），ArrayScan（ThermoFisher科学）或歌剧（Perkin Elmer公司）后执行。在表1提供的成像和分析的一些指导方针： HCS222图像采集准则 检测试剂 物镜 激发滤光片范围[峰/带宽（NM）] 排放过滤范围[峰/带宽（nm）] 赫斯特的HCS核染色 20X 四十○分之三百六十○ 四十零分之四百六十○（或五十分之五百三十五如有必要） HCS二抗，FITC标记的驴抗兔IgG 20X 四十零分之四百八五十零分之五百三十五 HCS二抗，Cy3标记的驴抗小鼠IgG 20X 五十零分之五百三十五五十○分之六百 HCS222图像分析准则 晶胞参数 检测 分割/测量 理由 细胞数，核特性赫斯特的HCS核染色核区（460 nm发射通道）。计算原子核的数目。 DNA含量（核武器强度）或核领域的分析，也有可能。 使用细胞数，核特性，以确定细胞的损失，毒性表型等，可以“过滤器”βIII-微管蛋白或GFAP表达获得单独的神经元和星形胶质细胞计数/刻画（强烈推荐）的原子核。 βIII-微管蛋白的表达，突起生长 HCS二抗，FITC标记的胞内区（535 nm发射通道）。 FITC标记的信号可能是用来区分突起的神经元细胞体（例如，通过最小/平均细胞的身体部位，最小/最大突起的长度和宽度）。确定参数，如总长度突起，突起计数/细胞等突起生长的测量可在神经细胞分化过程中或化学性损伤，疾病状态等调制可以“过滤”βIII-微管蛋白的表达，获得不同的神经元的特性（强烈推荐）的胞体。 GFAP的表达，星形胶质细胞区 HCS二抗，Cy3标记的共轭胞内区（600 nm发射通道）。 Cy3标记的信号可以用来定义星形胶质细胞的细胞质分割。确定参数，如平均细胞质的信号强度，细胞面积，等 GFAP的表达和星形胶质细胞面积的星形胶质细胞的发展，或作为一种化学性损伤，疾病状态的结果可能会在调制，等“过滤器”与GFAP的表达，获得独特的星形胶质细胞的特性（强烈推荐）的细胞体。 表1图像采集和分析指南- HCS222βIII-Tubulin/GFAP（联合培养）含量代表性的成果： 图1。 βIII-微管蛋白和GFAP immunofluorescence的混合大鼠神经细胞培养。 镀前几天神经播种在文化，星形胶质细胞所产生的原发性大鼠海马神经元或大鼠PC12细胞的原代大鼠海马星形胶质细胞共培养。主神经元培养一个额外的11天，而PC12s培养分化条件下（低血清/ NGF）增加2天。根据HCS222检测协议进行处理，固定和免疫细胞。细胞在细胞分析仪1000（3.3），20X（主神经元）或10X（PC12）物镜成像上的GE和分析细胞分析仪1000工作站（3.4）轴突生长和多目标分析算法中使用了GE顶板。赫斯特的HCS核染色（蓝色），βIII-微管蛋白（绿色）和GFAP（红色）荧光的融合图像。单独分析βIII-微管蛋白的荧光通道，允许突起生长分割（中间面板：概述蓝（初级神经元的胞 ​​体）或黄色（PC12），绿色（主神经元）或淡蓝色（PC12 ）的突起）。 GFAP的渠道分析允许星形胶质细胞的分割（ 底部面板：细胞核，细胞质蓝色概述绿色）。 GFAP的原代大鼠海马神经元/星形胶质细胞的共同文化的分割演示的能力，区分核/胞体，GFAP（+），（绿色概括）和GFAP（ – ）（红色），使不同的细胞计数神经元和星形胶质细胞混合培养设置。 图2。海马神经元/星形胶质细胞共同培养有毒强调的原代大鼠的剂量反应。 原代大鼠海马星形胶质细胞接种于96孔板（六）在生长介质和培养6天。原代大鼠海马神经元（直接从解冻），然后上方的镀前的星形胶质细胞，接种于培养基中培养11天。细胞经连续稀释的丙烯酰胺或过氧化氢的文化在过去24小时（最大浓度= 100mm和10mm的分别）。根据HCS222检测协议进行处理，固定和免疫细胞。细胞成像上的GE细胞分析仪1000（3.3），20X（10场/孔）和分析（核/胞浆/突起分割）使用GE的细胞分析仪1000工作站（3.4）轴突生长和多目标分析算法。所列数据是平均± SEM，N = 3。多个参数（突起生长，GFAP的强度，星形胶质细胞面积和神经元或星形胶质细胞计数）为剂量依赖性的发展趋势进行了调查。

Discussion

迄今为止， 在体外实验旨在研究使用混合培养的神经元和星形胶质细胞神经毒性风险评估中已有限。这是广为接受的神经胶质细胞中不可分割的神经元提供了空间和代谢支持，并在调节神经功能，包括神经细胞迁移，分化和突触活动的发挥至关重要的作用。胶质细胞的星形胶质细胞也释放细胞因子和其他可溶性因子，这是许多毒素的神经诱导周围神经组织的不良反应，以及促进双方的宽容能力。展示的神经胶质细胞相互作用的深入，合作文化的研究，星形胶质细胞已证明，以保护神经元免受氧化应激的毒性，而星形胶质细胞的功能，如抗氧化防御和细胞能量水平的维护，减值已被证明看房影响神经元的存活。最近的研究表明，星形胶质细胞在体外培养的神经毒性测试系统的使用可能被证明更切合人体中枢神经系统的结构和功能的神经细胞，单独。尽管越来越多的神经元，星形胶质细胞相互作用的生理意义的认识，以前一直难以执行这些相互作​​用的定量分析，在完整的细胞。高通量筛选的到来，使发展的强大的新的分析方法来解决这个问题。

在这项研究中，我们已经表明，HCA的可能是由多个神经元和星形胶质细胞在一个单一的检测表型的定量分析。在初级神经元，我们已经完成了的神经元的数量，神经轴突计数和突起的长度，如神经毒性标志的定量测量。在星形胶质细胞，反应性胶质化是一个已知的神经毒性的生物标志物的特点，GFAP的表达，星形胶质细胞的数量和星形胶质细胞形态的改变。我们已经证明，这些端点的每个人都可以很容易地通过HCA的评估。这些研究支持神经特异性的生物标志物HCA，可在体外试验中使用的电池的一部分，迅速 ​​屏幕为神经中毒的端点化学品的大量的概念。

Millipore公司的HCS222为神经元和星形胶质细胞共培养高含量分析试剂盒是由高品质的检测试剂和协议，同时在多种神经毒性的细胞模型的分析βIII-微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。高度验证，该试剂盒提供的试剂，允许用户规范检测，减少检测，检测变异，再现产生一个高信号背景比的图像。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X			Part No. CS201672	1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X			Part No. CS201649	1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X			Part No. CS201671	1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X			Part No. CS200437	1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component
Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X			Part No. CS200438	1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X			Part No. CS200434	1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X			Part No. CS200435	1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Wash Buffer, 1X			Part No. 2007643	1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components
Acrylamide (Control Compound), 10X			Part No. CS201679	1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X			Part No. CS201730	1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components
K-252a (Control Compound), 250X			Part No. CS201741	1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component
DMSO for Compound Serial Dilution			Part No. CS200441	1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component
Compound Dilution Buffer			Part No. CS200442	1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component
Plate Sealers			Part No. CS200443	10 each Millipore HCS222 Kit Components
tissue culture-treated black/clear bottom microplates
HCS imaging/analysis system