Neurotoxicity के उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए एक neuronal और astrocyte सह संस्कृति परख

Summary

यह लेख एक उपन्यास प्रोटोकॉल और अभिकर्मक सेट यौगिकों और न्यूरॉन्स और astrocytes उच्च सामग्री के विश्लेषण का उपयोग करने के सह संस्कृतियों पर उपचार के neurotoxic प्रभाव के प्रति संवेदनशील माप के लिए डिजाइन का वर्णन करता है. परिणाम दिखाना है कि उच्च सामग्री विश्लेषण neurotoxicity मूल्यांकन के लिए एक रोमांचक उपन्यास प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्व करता है.

Abstract

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with βIII-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis – changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation – within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling βIII-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

Protocol

सेल तैयार: पहले परख, संस्कृति और विकास मीडिया में न्यूरॉन्स / astrocytes के लिए सेल बोने के लिए जब तक ~ 70-80% मिला हुआ है (सेल पिघलना या अलगाव से सीधे बीज बोने की क्रिया जब तक). ब्याज की कोशिका प्रकार के लिए उपयुक्त विधि के माध्यम से संस्कृति बोतल / प्लेटों से कोशिकाओं को अलग. यदि आवश्यक हो, पाली – डी lysine या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कोट परख थाली कुओं कोशिका आसंजन बढ़ाने के लिए. सह astrocytes और न्यूरॉन्स की संस्कृतियों को एक साथ या sequentially वरीयता प्राप्त हो सकता है. अनुक्रमिक seedings के लिए, एक "बेसल" परत के रूप में पहला astrocytes के चढ़ाना की सिफारिश की है, neuronal चढ़ाना और भेदभाव के द्वारा पीछा किया, यदि आवश्यक हो,. कोशिका प्रकार, बाद में संस्कृति के समय, ब्याज के मापदंडों के लिए उपयुक्त के रूप में सेल घनत्व को समायोजित करने के लिए, आदि संस्कृति उम्र पर निर्भर करता है, सेल स्रोत और बोने घनत्व, प्राथमिक संस्कृतियों, GFAP अभिव्यक्ति या neurite परिणाम प्रसार की दर में काफी भिन्न हो सकते हैं – यह करने के लिए महत्वपूर्ण है विशेषताएँ और अपने सेल प्रणाली का अनुकूलन करने के लिए अपने प्रयोगात्मक मॉडल के लिए सबसे जैविक प्रासंगिकता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रभावी इमेजिंग, विभाजन और विश्लेषण HCS (चित्रा 1 देखें) का उपयोग कर के लिए प्रदान प्रदान. प्लेट (कोशिकाओं को 90 μL मीडिया में वरीयता प्राप्त हो सकता है, विष उपचार की सुविधा के रूप में नीचे तीन चरण में वर्णित) के लिए कोशिकाओं को जोड़ने के बाद, प्लेट एक स्तर की सतह पर कमरे के तापमान पर बैठने के लिए 15-30 मिनट के लिए, यहां तक ​​कि सेल वितरण को सक्षम करने की अनुमति. इस अवधि के बाद, विकास मीडिया में कम से कम 24 घंटे के लिए सेते कोशिकाओं (37 ° C / 5% सीओ 2), तो भेदभाव संस्कृति शर्तों पर स्विच करने के (जैसे, कम सीरम / NGF PC12 कोशिकाओं के लिए), के रूप में उपयुक्त है. संस्कृति जारी रखें जब तक कोशिकाओं संगम या भेदभाव के वांछित स्तर तक पहुँचने, सेल प्रकार के लिए उपयुक्त अंतराल पर मीडिया को बदलने. सेल उपचार (नियंत्रण यौगिकों, परीक्षण यौगिकों, आदि) इस संस्कृति की अवधि के दौरान किसी भी बिंदु पर शुरू किया जा सकता है, ब्याज के उपचार के समय पाठ्यक्रम के लिए उपयुक्त के रूप में. Acrylamide, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और कश्मीर 252a neurotoxic नियंत्रण यौगिकों के रूप में प्रदान की जाती हैं. पर्याप्त अभिकर्मकों डुप्लिकेट सभी पाँच 96 अच्छी तरह प्लेटें के लिए 12 सूत्री खुराक प्रतिक्रिया घटता (एक DH 2 हे या DMSO खुराक प्रतिक्रिया के भीतर नियंत्रण सेट सहित) के लिए प्रदान की जाती हैं. यौगिकों 250X (कश्मीर 252a के लिए, 1 सुक्ष्ममापी की एक अधिकतम उपचार संभालने) एकाग्रता या 10X (acrylamide और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लिए, 100 मिमी और 10 मिमी, क्रमशः की अधिकतम उपचार संभालने) पर प्रदान की जाती हैं. की सिफारिश की उपचार आधा लॉग तैयारी शामिल है (1: 10 √) DMSO में 250X परिसर के धारावाहिक कमजोर पड़ने, यौगिक कमजोर पड़ने बफर में कमजोर पड़ने द्वारा पीछा 10X (10X नियंत्रण DH 2 हे में प्रारंभिक यौगिकों serially बाँझ DH हे दो में किया जा सकता है सीधे पतला या मिश्रित कमजोर पड़ने बफर). प्रत्येक उपचार के 10 μL तो पहले से ही एक अच्छी तरह से मौजूद संस्कृति मीडिया के 90 μL जोडा जा सकता है एक अंतिम 1X एकाग्रता (0.4% DMSO या 10% DH 2 हे) के लिए हो. नमूना डेटा यौगिक उपचार के 24 या 96 घंटे के लिए 37 पर ° सी से पहले निर्धारण करने के लिए प्रदान की जाती है. सेल फिक्सेशन और Immunofluorescent धुंधला: नोट: समय धुंधला ~ 2.5 बाद निर्धारण घंटे है. कुओं धुंधला कदम के बीच शुष्क करने की अनुमति नहीं है . आकांक्षा और अभिकर्मकों के ऋण वितरण के कम प्रवाह दरों पर आयोजित किया जाना चाहिए किसी भी सेल द्रव कतरनी की वजह से नुकसान कम . सभी संस्करणों 'अच्छी तरह से प्रति' सिफारिश की एक 96 – अच्छी तरह से microplate की एक अच्छी तरह से एकल देखें . मात्रा 'सभी 96 अच्छी तरह से थाली के अनुसार' की सिफारिश की तरल से निपटने की मात्रा घटाने के लिए 25% अधिक शामिल हैं. सभी धुंधला कदम कमरे के तापमान (आर टी) पर प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी buffers और एंटीबॉडी समाधान आरटी पर कम से कम 24 घंटे के लिए स्थिर रहे हैं . संस्कृति की अवधि के अंत में, पूर्व गर्म HCS फिक्सेशन कमरे तापमान (आर टी) या 37 º सी करने के लिए समाधान (2X) अगर वांछित (12 mL/96-well थाली). एक रासायनिक धूआं हुड में / अच्छी तरह से सीधे संस्कृति मीडिया 100 μL जोड़ने और आरटी पर 30 मिनट के लिए तय की अनुमति है. लगानेवाला / विष से युक्त मीडिया निकालें और खतरनाक कचरे के लिए नियमों के साथ अनुपालन में के निपटान (MSDS देखें). यदि धुंधला हो जाना करने के लिए तुरंत आगे बढ़ने से, प्रत्येक दो बार अच्छी तरह कुल्ला HCS immunofluorescence बफर के 200 μL के साथ. वैकल्पिक रूप से, अगर प्लेटों को एक बाद में समय पर दाग हो रहे हैं, धो बफर के 200 μL के साथ दो बार कुल्ला, तो दूसरा खंड के कुओं और दुकान धुंधला हो जाना जब तक 4 º सी में कसकर मोहरबंद प्लेटें में कुल्ला छोड़. यदि तय नमूने 4 º धुंधला पहले सी पर संग्रहित किया गया है, 200 μL HCS immunofluorescence बफर के साथ धुंधला प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले दो बार कुल्ला. निम्नानुसार खरगोश एंटी – βIII / ट्यूबिलिन माउस विरोधी GFAP HCS प्राथमिक एंटीबॉडी (6 mL/96-well थाली) के समाधान काम तैयार: HCS immunofluorescence बफर के 5.88 एमएल प्रत्येक thawed प्राथमिक एंटीबॉडी के 60 μL जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स. पिछले immunofluorescence बफर कुल्ला निकालें. एक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 μL जोड़ें और आरटी से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालेंसमाधान. 200 μL HCS immunofluorescence बफर के साथ तीन बार कुल्ला करें. निम्नानुसार HCS माध्यमिक एंटीबॉडी / Hoechst HCS परमाणु दाग ​​(6 mL/96-well प्लेट) का काम कर समाधान तैयार: प्रत्येक thawed माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 μL और thawed Hoechst HCS परमाणु के 30 μL HCS immunofluorescence बफर के 5.91 एमएल दाग जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स, प्रकाश से समाधान की रक्षा. पिछले HCS immunofluorescence बफर कुल्ला निकालें. HCS माध्यमिक एंटीबॉडी / Hoechst HCS परमाणु दाग ​​समाधान के 50 μL जोड़ें और आरटी, प्रकाश से संरक्षित 1 घंटे के लिए सेते हैं. HCS माध्यमिक / एंटीबॉडी Hoechst HCS परमाणु दाग ​​समाधान निकालें. 200 μL HCS immunofluorescence बफर के साथ दो बार कुल्ला. पिछले HCS immunofluorescence बफर कुल्ला निकालें. HCS धो बफर के 200 μL के साथ दो बार कुल्ला, कुओं में दूसरी कुल्ला मात्रा छोड़ने. 4 º सी में सील की थाली और छवि तुरंत या दुकान, प्लेट इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक प्रकाश से रक्षा की. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण: इमेजिंग और दाग प्लेटों के विश्लेषण सहित सेल विश्लेषक में (जीई हेल्थकेयर) उपलब्ध HCS प्लेटफार्मों, ArrayScan (ThermoFisher वैज्ञानिक) या ओपेरा (Perkin एल्मर) की एक किस्म पर प्रदर्शन किया जा सकता है. तालिका 1 में इमेजिंग और विश्लेषण के लिए कुछ दिशा निर्देश प्रदान की जाती हैं: HCS222 छवि अधिग्रहण दिशानिर्देश जांच अभिकर्मक उद्देश्य लेंस उत्तेजना फ़िल्टर रेंज [चोटी / बैंडविड्थ (एनएम)] उत्सर्जन फ़िल्टर रेंज [चोटी / बैंडविड्थ (एनएम)] Hoechst HCS परमाणु दाग 20X 360/40 460/40 (या यदि आवश्यक 535/50) HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, FITC – गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 20X 480/40 535/50 HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, Cy3 – गधा विरोधी माउस आईजीजी 20X 535/50 600/50 HCS222 छवि विश्लेषण दिशानिर्देश सेल पैरामीटर खोज / विभाजन मापन दलील सेल नंबर, परमाणु अभिलक्षण Hoechst HCS परमाणु दाग परमाणु क्षेत्र (460 एनएम उत्सर्जन चैनल). नाभिक की संख्या की गणना. डीएनए सामग्री (परमाणु तीव्रता) या परमाणु क्षेत्र विश्लेषण भी संभव है. सेल नंबर, परमाणु विशेषताओं का प्रयोग करें "फिल्टर" βIII ट्यूबिलिन या GFAP अभिव्यक्ति के साथ जुड़े अलग neuronal और astrocytic सेल मायने रखता है / characterizations (पुरजोर सिफारिश की है) प्राप्त लोगों के लिए नाभिक सेल हानि, विषाक्तता phenotypes, आदि का निर्धारण. βIII ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति, neurite परिणाम HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, FITC संयुग्मित Cytoplasmic क्षेत्र (535 एनएम उत्सर्जन चैनल). FITC संकेत neurites (उदाहरण के लिए, न्यूनतम / औसत सेल शरीर क्षेत्रों, न्यूनतम / अधिकतम neurite लंबाई और widths के माध्यम से) से neuronal सेल निकायों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल neurite लंबाई, neurite मायने रखता है / सेल, आदि जैसे मानकों का निर्धारण Neurite परिणाम माप neuronal भेदभाव के दौरान या रासायनिक चोट, रोग राज्यों, आदि का एक परिणाम के के रूप में modulated किया जा सकता है "फिल्टर" βIII – ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति के साथ जुड़े अलग neuronal लक्षण वर्णन (पुरजोर सिफारिश की है) प्राप्त लोगों के लिए सेल शरीर. GFAP अभिव्यक्ति, astrocyte क्षेत्र HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, Cy3 संयुग्मित Cytoplasmic क्षेत्र (600 एनएम उत्सर्जन चैनल). Cy3 संकेत astrocytic cytoplasmic विभाजन को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. औसत cytoplasmic संकेत तीव्रता, सेल क्षेत्र, आदि जैसे मानकों का निर्धारण GFAP अभिव्यक्ति और astrocyte सेल क्षेत्र astrocyte विकास के दौरान या रासायनिक चोट, रोग राज्यों का एक परिणाम के के रूप में modulated किया जा सकता है, आदि GFAP अभिव्यक्ति के साथ जुड़े करने के लिए अलग astrocytic लक्षण वर्णन (पुरजोर सिफारिश की है) प्राप्त लोगों के लिए सेल निकायों "फिल्टर". HCS222 βIII-Tubulin/GFAP परख (सह – संस्कृति) – टेबल 1 छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दिशानिर्देश प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1. βIII ट्यूबिलिन और GFAP immunofluoreमिश्रित चूहे तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों के scence. या तो प्राथमिक चूहे hippocampal न्यूरॉन्स या चूहा PC12 कोशिकाओं के साथ प्राथमिक चूहे hippocampal astrocytes के सह संस्कृतियों संस्कृति में कई दिनों बाद neuronal बोने द्वारा पूर्व चढ़ाना astrocytes द्वारा उत्पन्न किया गया. प्राथमिक न्यूरॉन्स एक अतिरिक्त 11 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे, जबकि PC12s भेदभाव शर्तों (कम सीरम / NGF) के तहत एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे. सेल से निपटने के निर्धारण, और immunostaining HCS222 परख प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया. कक्ष जीई पर सेल विश्लेषक 20X (प्राथमिक न्यूरॉन्स) या 10X (PC12) उद्देश्य बढ़ाई 1000 (3.3) में imaged थे और सेल विश्लेषक 1000 (3.4) कार्य केंद्र neurite परिणाम और मल्टी लक्ष्य विश्लेषण एल्गोरिदम में जीई का उपयोग करने का विश्लेषण उच्च पैनल. Hoechst HCS दाग परमाणु (नीला), βIII ट्यूबिलिन () हरे और GFAP प्रतिदीप्ति (लाल) के इनकार छवियाँ. (सेल शरीर नीला (प्राथमिक न्यूरॉन्स में उल्लिखित) या पीला (PC12), (प्राथमिक न्यूरॉन्स) हरे या प्रकाश (PC12) नीले में neurites मध्य पैनल) प्रतिदीप्ति βIII ट्यूबिलिन चैनल के अलग विश्लेषण neurite परिणाम विभाजन के लिए अनुमति देता है. GFAP चैनल के विश्लेषण astrocyte विभाजन (: नाभिक नीले, हरे रंग में cytoplasm में उल्लिखित नीचे पैनल) के लिए अनुमति देता है . (-) प्राथमिक चूहे hippocampal / न्यूरॉन astrocyte सह संस्कृति के लिए GFAP विभाजन नाभिक / सेल शरीर है कि GFAP (+) (हरे रूपरेखा) हैं और उन है कि GFAP हैं के बीच भेद करने की क्षमता को दर्शाता है (लाल), के लिए अलग सेल की गिनती को सक्षम एक मिश्रित संस्कृति की स्थापना में न्यूरॉन्स और astrocytes. चित्रा 2. प्राथमिक चूहे की खुराक प्रतिक्रियाओं hippocampal न्यूरॉन / astrocyte विषाक्त तनाव सह संस्कृतियों. प्राथमिक चूहे hippocampal astrocytes (P6) 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वृद्धि मीडिया में चढ़ाया गया और 6 दिनों के लिए सभ्य है. प्राथमिक चूहे hippocampal न्यूरॉन्स (प्रत्यक्ष पिघलना से) तो पूर्व चढ़ाया astrocytes के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त थे और विकास मीडिया में 11 दिनों के लिए सुसंस्कृत. कक्ष संस्कृति के पिछले 24 घंटे के लिए acrylamide या हाइड्रोजन पेरोक्साइड (अधिकतम सांद्रता = 100mm और 10mm क्रमशः) के धारावाहिक dilutions के साथ इलाज किया गया. सेल से निपटने के निर्धारण, और immunostaining HCS222 परख प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया. कक्ष जीई पर सेल विश्लेषक 20X (10 क्षेत्रों / अच्छी तरह से) 1000 (3.3) में imaged थे और (परमाणु / cytoplasmic / neurite विभाजन) विश्लेषण सेल विश्लेषक 1000 (3.4) कार्य केंद्र neurite परिणाम और मल्टी लक्ष्य विश्लेषण एल्गोरिदम में जीई का उपयोग कर. प्रस्तुत डाटा ± SEM, n = 3 मतलब हैं. खुराक पर निर्भर रुझान के लिए एकाधिक मापदंडों (neurite परिणाम, GFAP तीव्रता, astrocyte क्षेत्र और neuronal या astrocytic कोशिकाओं की गिनती) जांच की गई.

Discussion

तिथि करने के लिए, इन विट्रो neurotoxicity जोखिम न्यूरॉन्स और astrocytes के मिश्रित संस्कृतियों का उपयोग आकलन अध्ययन के लिए बनाया गया प्रयोगों में सीमित किया गया है. यह अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है कि glial कोशिकाओं को न्यूरॉन्स के लिए स्थानिक और चयापचय सहायता प्रदान करने में अभिन्न हैं, और modulating neuronal प्रवास, भेदभाव और synaptic गतिविधि सहित कई neuronal कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. Glial astrocytes भी जारी साइटोकिन्स और अन्य घुलनशील कारक हैं जो दोनों neuronal ऊतक आसपास में प्रतिकूल प्रतिक्रिया उत्प्रेरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बढ़ावा देने के कई toxins के neuronal सहिष्णुता के सक्षम हैं. Neuronal glial बातचीत की गहराई दिखाते हुए सह संस्कृति के अध्ययन में, astrocytes के लिए oxidative तनाव की विषाक्तता के खिलाफ न्यूरॉन्स की रक्षा दिखाया गया है, जबकि astrocytic कार्यों, एंटीऑक्सीडेंट रक्षा और सेलुलर ऊर्जा के स्तर के रखरखाव के रूप में की हानि को दिखाया गया है गंभीर neuronal अस्तित्व प्रभावित. हाल ही के अध्ययन का सुझाव है कि इन विट्रो neurotoxicity परीक्षण प्रणाली में में astrocytes का उपयोग neuronal कोशिकाओं की तुलना में अधिक मानव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र संरचना और समारोह के लिए प्रासंगिक अकेले साबित हो सकता है. Neuronal astrocytic बातचीत के शारीरिक महत्व की बढ़ती जागरूकता के बावजूद, यह पहले से मुश्किल हो गया है बरकरार कोशिकाओं में इन संबंधों के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन. उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के आगमन के शक्तिशाली नए assays के विकास के इस पते पर सक्षम बनाता है.

इस अध्ययन में, हम दिखा दिया है कि एक एकल परख के भीतर एकाधिक neuronal और astrocytic phenotypes के मात्रात्मक विश्लेषण HCA द्वारा संभव बना रहे हैं. प्राथमिक न्यूरॉन्स में हम जैसे neuronal नंबर, neurite गिनती और neurite लंबाई neurotoxicity मार्करों के मात्रात्मक मापन प्रदर्शन किया है. Astrocytes में, प्रतिक्रियाशील gliosis neurotoxicity के एक ज्ञात biomarker, GFAP अभिव्यक्ति, astrocyte संख्या और astrocyte आकारिकी में परिवर्तन द्वारा विशेषता है. हमने दिखा दिया है कि इन endpoints के प्रत्येक आसानी HCA के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है है. ये अध्ययन अवधारणा है कि इन विट्रो परीक्षणों में तंत्रिका विशिष्ट biomarkers की HCA के एक बैटरी के हिस्से के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से neurotoxic endpoints के लिए रसायनों के बड़ी संख्या स्क्रीन का समर्थन करते हैं.

Millipore HCS222 न्यूरॉन्स और astrocytes सह संस्कृति के लिए उच्च सामग्री विश्लेषण किट उच्च गुणवत्ता का पता लगाने अभिकर्मकों और एक साथ neurotoxicity के सेलुलर मॉडल की एक विस्तृत विविधता में βIII ट्यूबिलिन और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) रूपरेखा के लिए प्रोटोकॉल शामिल है. अत्यधिक मान्य इस किट के साथ प्रदान अभिकर्मकों उपयोगकर्ता assays के मानकीकरण के लिए, परख करने के लिए परख परिवर्तनशीलता को कम से कम, और reproducibly एक उच्च अनुपात संकेत करने के लिए पृष्ठभूमि के साथ छवियों को उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X			Part No. CS201672	1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X			Part No. CS201649	1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X			Part No. CS201671	1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X			Part No. CS200437	1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component
Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X			Part No. CS200438	1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X			Part No. CS200434	1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X			Part No. CS200435	1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Wash Buffer, 1X			Part No. 2007643	1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components
Acrylamide (Control Compound), 10X			Part No. CS201679	1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X			Part No. CS201730	1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components
K-252a (Control Compound), 250X			Part No. CS201741	1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component
DMSO for Compound Serial Dilution			Part No. CS200441	1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component
Compound Dilution Buffer			Part No. CS200442	1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component
Plate Sealers			Part No. CS200443	10 each Millipore HCS222 Kit Components
tissue culture-treated black/clear bottom microplates
HCS imaging/analysis system