Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray
Summary
O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus,<em> P. taeda</em>, E outras espécies de coníferas. Aqui, vamos mostrar pré e pós-hibridação manuseio e técnicas de lavagem que pode ser usado com esta matriz para produzir uma maior consistência, artefatos reduzida, e fundos mais baixos.
Abstract
PtGen2 é um microarray de cDNA contendo funcionalidade 26.496 ESTs pinheiros loblolly amplificada. A matriz é produzido em nosso laboratório a ser utilizado por pesquisadores que estudam a expressão gênica em espécies de coníferas de pinheiros e outras. PtGen2 foi desenvolvido como resultado de nossos esforços gene descoberta em pinheiro, e é composta de seqüências identificadas principalmente a partir de tecidos de raiz, mas também de agulha e tronco 1,2. PtGen2 foi testado por hibridação diferentes Cy dye-rotulados cDNAs alvo de coníferas , usando tanto amplificadas e não amplificadas métodos de rotulagem indireta, e também testados com uma série de condições de hibridização e lavagem. Este vídeo enfoca a manipulação e processamento de slides antes e após a pré-hibridização, bem como após a hibridização, utilizando-se algumas modificações para os procedimentos desenvolvidos anteriormente 3,4. Também estão incluídos, em forma de texto único, são os protocolos utilizados para a geração, rotulagem e limpeza de cDNA s alvo, bem como informações sobre o software usado para processamento de dados a jusante.
PtGen2 é impresso com um buffer de impressão proprietária que contém altas concentrações de sal que pode ser difícil de remover completamente. As lâminas são lavadas primeiro em uma solução SDS quente antes de pré-hibridização. Após a pré-hibridização, as lâminas são lavadas vigorosamente em várias mudanças de água para completar a remoção dos sais remanescentes. LifterSlips ™ são limpos e, em seguida, posicionado na slides e rotulado cDNA é cuidadosamente carregado no microarray por meio de ação capilar que prevê a distribuição uniforme da amostra em todo o slide, e reduz a chance de incorporação de espuma. Hibridação de metas para a matriz é feita a 48 ° C em condições de alta umidade. Após a hibridização, uma série de lavagens padrão são feitas a 53 ° C e temperatura ambiente por longos períodos. Processamento PtGen2 slides usando esta técnica reduz o sal ea SDS-artefatos derivados muitas vezes visto quando a matriz é processada menos rigorosa. Hibridação alvos derivado de várias fontes diferentes de coníferas RNA, este protocolo de processamento rendeu menos artefatos, fundo reduzida, e desde uma maior consistência entre os diferentes grupos experimentais de matrizes.
Protocol
Discussion
PtGen2 é um recentemente desenvolvido, personalizado microarray de cDNA, que foi projetado para ser usado principalmente pela comunidade de pesquisa loblolly pinho. Os resultados preliminares gerados até o momento têm demonstrado a matriz para ser uma ferramenta valiosa na avaliação de eventos transcricionais que ocorrem em resposta ao estresse hídrico, bem como no monitoramento das mudanças que ocorrem durante o desenvolvimento do embrião no pinheiro bravo, Pinus pinaster 5,6 Temos também d…
Acknowledgements
A rotulagem, a hibridização, e protocolos de lavar aqui contêm algumas modificações para os desenvolvidos anteriormente pelo Dr. J. Quackenbush enquanto no The Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy no Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e Dr. Rob Alba, enquanto no Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Outro | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Outro | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Outro | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Outro | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Outro | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
Referências
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
