Summary
Lesão traumática da medula espinhal interrompe a comunicação com o cérebro. Para restaurar a conectividade perdida nós utilizamos um enxerto de nervo periférico para fornecer um substrato de fibras em regeneração em combinação com fatores neurotróficos e matriz de modulador enzimas para remover moléculas inibidoras para promover o crescimento de longa distância.
Abstract
Lesão traumática da medula espinhal (SCI) causa a morte de neurônios, a interrupção do motor e de fibras nervosas sensoriais (axônio) vias e interrupção na comunicação com o cérebro. Um dos objetivos de nossa pesquisa é o de promover a regeneração do axônio para restaurar a conectividade em todo o local da lesão. Para conseguir isso, desenvolvemos um nervo periférico (PN) de enxerto técnica onde os segmentos do nervo ciático ou são colocados diretamente entre as extremidades danificados da medula espinhal ou são usados para formar uma ponte sobre a lesão. Existem várias vantagens para esta abordagem em relação ao transplante de outros tecidos neurais; axônios em regeneração pode ser direcionada para uma área-alvo específico, o número e fonte de regeneração de axônios é facilmente determinada por rastreamento técnicas, o enxerto pode ser utilizado para experimentos eletrofisiológicos para medir recuperação funcional associado com axônios no enxerto, e é possível usar um nervo autólogo para reduzir a possibilidade de rejeição do enxerto. Em nosso laboratório temos realizado tanto autólogos (doador e receptor são o mesmo animal) e heteróloga (doador e receptor são animais diferentes) enxertos com resultados comparáveis. Esta abordagem tem sido usada com sucesso em situações de lesões agudas e crônicas. Axônios regenerados que atingem a extremidade distal do enxerto PN muitas vezes não conseguem estender para trás para a medula espinhal, por isso usamos microinjeções de condroitinase para degradar moléculas inibidoras associados com o tecido cicatricial ao redor da área de SCI. Ao mesmo tempo, nós descobrimos que o fornecimento de crescimento exógeno e moléculas tróficas incentiva longa distância regrowth axonal na medula espinhal. Vários meses após o transplante realizamos uma variedade de testes anatômicas, comportamentais e eletrofisiológicos para avaliar a recuperação da função nos nossos animais com lesão medular. Esta abordagem experimental tem sido utilizado com sucesso em vários modelos de lesão medular, em diferentes níveis de lesões e em diferentes espécies (rato, camundongo e gato). Importante, a abordagem de enxerto de nervo periférico é eficaz na promoção da regeneração de neurônios aguda e crônica feridos.
Protocol
1) Preparação para a cirurgia microscópica
- A estação cirúrgica precisa ser limpo e higienizado com uma solução de água sanitária diluída antes de definir instrumentos e materiais acessórios. Instrumentos serão autoclavados um dia antes da cirurgia e armazenado em um recipiente esterilizado. Ligue o Esterilizador Bead Quente (Ferramentas Ciência Fine) usado para remover patógenos e contaminantes microbianos de instrumentos entre os procedimentos em animais diferentes.
- Plug na barreira térmica usada para manter a temperatura corporal durante o procedimento cirúrgico. Estabelecidos cotonetes e gaze utilizada para controlar o sangramento. Prepare pequeno (<2mm 3) peças de Espuma Gel para ser usado para micro-hemostasia e mergulhe em uma solução salina estéril.
- Rat lugar em uma câmara de indução e anestesiar com isoflurano (5% vaporizado em oxigênio, vazão 2,0 L / min). Remover animais da câmara para a mesa de preparação e raspar uma ampla área de pele a partir do campo destinado cirúrgico. Limpe com início de álcool isopropílico a 70% no centro do campo e irradiando para fora, seguido por lavagem com solução Polyhydroxidine (Xenodine) da mesma maneira. Repita esta sequência de lavagens 3 vezes.
- Coloque o animal na barreira térmica, o nariz ea boca com tampa cone inalação, reduzir o isoflurano a 3% e vazão de 0,2 L / min. Entregar dose adequada de antibiótico (Ampicilina) por sub-cutânea de injeção e analgésico (buprenorfina 0,05 mg / kg) por via intramuscular.
- O cirurgião vai esfregar as mãos com solução Xenodine e enxágüe com água. Um vestido cirúrgica estéril será montado para o cirurgião; mãos será secado com uma toalha estéril e coberto com luvas estéreis. Este procedimento é seguido para cada procedimento cirúrgico descrito neste texto.
- A tampa que cobre o instrumentos esterilizados serão removidos por um assistente e instrumentos serão dispostas em uma cobertura estéril pelo cirurgião.
2) Transecção da PN para promover a degeneração
- Com o animal deitado de lado fazer uma incisão linha reta da cabeça do fêmur em direção ao joelho, mantendo paralelamente e cerca de três milímetros do fêmur. Cortar o superficial músculos bíceps femoral ao longo da mesma linha que a incisão na pele, para expor o músculo vasto lateral subjacente.
- Usando uma tesoura faça um pequeno corte no vasto lateral, perto do joelho e estender isto para a cabeça do fêmur. Novamente com uma tesoura delicadamente separar o vasto lateral até a conjoined ramos do nervo tibial e peroneal do nervo ciático são visualizadas (que corre paralelo ao fêmur).
- Traço desses ramos para a cabeça do fêmur até o tronco principal do nervo ciático é identificado. Logo abaixo da bifurcação do nervo ciático utilize uma pinça fina para separar cuidadosamente tecido conjuntivo (epineuro) em torno do ramo do nervo tibial (este é o maior ramo).
- Uma vez isolados deslizamento uma ligadura de seda 6-0 ao redor do nervo tibial e aperte. Use uma tesoura para micro transecto nervo rostral à ligadura. Passe a linha de sutura através do músculo vasto lateral e amarrar com um nó. Isto irá fornecer uma linha para facilitar a localização do fim do corte do nervo tibial quando o nervo é para ser colhido 70-10 dias depois.
- Degeneração do nervo tibial anterior à enxertia proporciona um ambiente mais adequado para o crescimento axonal do que uma preparação nervo fresco.
- Fechar o músculo vasto lateral com seda 6-0. Fechar o músculo bíceps femoral com seda 6-0. Feche a pele com grampos de sutura Michel. Desligue o fluxo de isoflurano, remova o cone do nariz inalação e animal lugar na realização de gaiola na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo.
3) A remoção do segmento PN
- Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica.
- Remova grampos de sutura e incisão da pele em separado anterior. Corte através de sutura do músculo superficial para expor vasto lateral e corte através de sutura em músculo.
- Traçar a linha de sutura para cortar final do nervo tibial e remover a sutura de nervo. Use uma pinça fina para dissecar epineuro de um comprimento de 15 mm do nervo tibial e cortou essa extremidade distal. Remova o segmento do nervo e mergulhe em solução estéril Sal Hanks Balanced.
- Se este é um experimento do enxerto heterólogo eutanásia do animal por meio de injeção intraperitoneal de Euthasol. Se este é um experimento enxerto autólogo, o músculo da perna ea pele é fechada, tal como descrito em 2.6) e os animais preparadas para lesão da medula espinhal cervical, conforme descrito abaixo.
4) lesão hemissecção Cervical e transplante
1 dia
- Anestesiar animais, fazer a barba e limpar a intençãocampo cirúrgico ded como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica. Administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4).
- Localize o entalhe occipital eo processo dorsal proeminente T2 vertebral e fazer uma incisão no comprimento total entre esses marcos externo. Atravessam a linha média do músculo trapézio superficial e separar os músculos subjacentes rombóide cervical. Manter os músculos além inserindo um espalhador.
- Os músculos supra-espinhal profundas devem ser cortados a partir dos processos dorsal vertebral C4, C5 e C6. Rongeurs usando realizar uma laminectomia parcial de C5 para expor todo o lado direito e na porção medial do lado esquerdo da medula espinhal. Use a veia dorsal proeminente como um marco para a linha média da medula espinhal.
- Use uma lâmina de bisturi ou micro-agulha de calibre 30 para perfurar a dura-máter e estender a incisão sobre a medula espinhal C5. Faça uma pequena incisão no subarachnoid subjacente e pia-máter.
- Com um copo puxado micro-cânula começar a aspirar o lateral, dorsal direita da medula espinhal, usando uma pressão suave e micro-pinças para separar o tecido e facilitar a sua remoção. Continue com parcelas intermediárias e ventral da medula espinhal para criar uma cavidade 2 milímetros de comprimento que é completa de dorsal para ventral e da linha média para as meninges lateral.
- Lugar salina encharcada de espuma gel na cavidade para realização da hemostasia.
- Remover o segmento do nervo periférico da solução Hanks. Descascar delicadamente o epineuro do 3 milímetros proximal do segmento do nervo e appose este fim para a parede rostral da cavidade lesão hemissecção. Assegurar o segmento com 10-0 sutura através do epineuro para a dura-máter, em seguida, sutura da dura-máter fechada sobre a extremidade do enxerto implantado.
- Sandwich do enxerto entre 2 pedaços de membrana silastic (Biobrane) para proteção e isolamento fácil em um ponto mais tarde. Lugar ao lado do C6, C7 e T1 processos vertebral. Não appose final nervo distal à medula espinhal ou tecido muscular.
- Músculos próximos em camadas com fio de sutura 4-0 e incisão na pele estreita com grampos de sutura.
- Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo.
Dia 21
- Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). Cortar suturas superficiais para expor membrana silastic ao redor do enxerto de nervo. Cuidadosamente livre do comprimento do nervo da membrana silastic usando uma pinça fina e tesoura primavera e refletem a partir do campo cirúrgico.
- Executar uma laminectomia parcial no lado direito do processo C7 vertebral. Pierce as meninges como acima (4.4) e por aspiração preparar a 1 mm 3 cavidade lesão dorsal quadrante na medula espinhal C7. Use soro fisiológico embebido de espuma em gel para realização da hemostasia e depois substituir com espuma de gel embebido com condroitinase ABC. Tratar o local da lesão durante 15 minutos, proporcionando espuma gel fresco condroitinase encharcada de cada 5 minutos.
- Cobrir o comprimento externo do enxerto de nervo com membrana Silastic. Fechar músculos superficiais com 4-0 ea incisão na pele com clipes ferida. Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo.
Dia 23
- Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). Cortar suturas superficiais para expor membrana silastic ao redor do enxerto de nervo. Não perturbe o enxerto, mas sim expor o local do enxerto C7 e usar uma seringa Hamilton com puxada de vidro cânula para microinject 1μl de condroitinase ABC para o lado direito da medula espinhal de cerca de 1 mm distal à aposição de enxerto a medula espinhal.
- Descascar delicadamente o epineuro do 2 milímetros distal do segmento do nervo e appose este fim para a cavidade lesão C7. Assegurar o segmento com 10-0 sutura através do epineuro a dura-máter.
- Fechar músculos superficiais com 4-0 ea incisão na pele com clipes ferida. Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo.
5) a gravação eletrofisiológicos do potencial de ação no enxerto e distal da medula espinhal
- Para determinar se a atividade elétrica é transmitida através de axônios que se regenerado no PNG primeiro devemos expor e isolar o enxerto. Cuidados especiais devem ser tomados durante este procedimento para evitar danos físicos do enxerto e é neste ponto que o uso de membrana Silastic após a colocação do enxerto é importante. Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). º lugaranimais e na barreira térmica.
- Após a abertura da pele e separando músculos superficiais, tiras de membrana Silastic são identificados e cuidadosamente dissecado livre do enxerto.
- Rongeurs usando remover o processo dorsal vertebral imediatamente rostral e caudal para o PNG-espinhal sites de aposição do cordão umbilical. Tome cuidado para não perturbar o enxerto muito durante esta abordagem. Faça uma fenda na dura-máter em ambos os níveis.
- Aproximadamente um centímetro rostral ao C5 local aposição de enxerto da medula espinhal inserir um único fio (platina irídio-mix) eletrodo estimulante para a medula espinhal ipsilateral à lesão, a uma profundidade de aproximadamente 1mm. Levante cuidadosamente a porção central do enxerto em um eletrodo bipolar viciado. Fornecer pulsos único estimulante de 10μA com duração 100μsec e determinar se existem potenciais de ação viajando através dos axônios regenerados em que o enxerto.
- Alterne as ligações ea posição dos fios de modo que o eletrodo viciado torna-se o eletrodo estimulando eo único fio é inserido na medula espinhal distal à aposição de PNG para a medula espinhal e tentar gravar potenciais de ação na medula espinhal.
- No final do experimento fornecer um trem de 1mA estímulos de duração 100μsec a 50Hz, para um total de 1h. Euthanize animais 1hr depois, perfundir com paraformaldeído 4% e tecido da medula espinhal processo para a detecção imunocitoquímica de cFos em neurônios que foram ativados por axônios regenerados no PNG.
6) rotulagem retrógrada dos neurônios que regeneram axônios para o PNG e rotulagem anterógrada de axônios que regeneram de volta para a medula espinhal
- Para animais não testados por medidas eletrofisiológicas é possível identificar a fonte de axônios que crescem no enxerto e no curso de sua rescisão na medula espinhal. Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e expor o PNG, conforme descrito no item 6.1 acima.
- Use uma tesoura para cortar micro através do enxerto em seu ponto médio e acabar com a epineuro das extremidades cortadas do enxerto. Refletir as pontas cortadas longe um do outro e colocar cada um em uma folha de parafilme.
- Coloque um chumaço de espuma de gel embebido com True Blue na extremidade cortada proximal aos neurônios etiqueta que contribuiu com um axônio para o PNG. Coloque um chumaço de espuma de gel embebido em biotinilado dextran amina (BDA) na extremidade distal para cortar axônios rótulo que se estendem da parte traseira do enxerto para a medula espinhal.
- Euthanize animais 3-4d depois, perfundir com paraformaldeído 4% e cérebro processar e seções do tecido da medula espinhal para microscopia fluorescente para True Blue neurônios rotuladas ou para BDA histoquímica para axônios rotulados.
7) lesão torácica transecção completa e transplante
Isto oferece uma abordagem alternativa ao modelo de lesão cervical hemissecção acima. Aqui uma lesão mais grave, bilateral é produzida e segmentos de nervo periférico são colocados na cavidade lesão a tempo de tocos e rostral e caudal da medula lesionada.
1 dia
- Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica. Administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4).
- Identificar T12 nível vertebral no ponto de inserção da última costela. Fazer incisão na pele a partir deste ponto rostral sobre os processos vertebral T11, T10 e T9. Cortar fáscia superficial através dos músculos supra-espinhal associada a estes três processos.
- Realizar laminectomia completa do processo T10 vertebral (sobrejacente T12 segmento da medula espinhal). Use uma lâmina de bisturi ou micro-agulha de calibre 30 para perfurar a dura-máter e estender a incisão sobre a medula espinhal T12. Faça uma pequena incisão no subarachnoid subjacente e pia-máter.
- Com um copo puxado micro-cânula começar a aspirar a medula espinhal T12 bilateralmente, usando uma pressão suave e micro-pinças para separar o tecido e facilitar a sua remoção. Continue com parcelas intermediárias e ventral da medula espinhal para criar uma cavidade 3 milímetros de comprimento que é dorsal e ventral completa para entre as meninges lateral.
- Use soro fisiológico embebido de espuma em gel para realização da hemostasia e depois substituir com espuma de gel embebido com condroitinase ABC. Tratar o local da lesão durante 15 minutos, proporcionando espuma gel fresco condroitinase encharcada de cada 5 minutos.
- Remover o segmento do nervo periférico de solução Hank s. Suavemente refletem a epineuro do 4 milímetros proximal do segmento do nervo e corte um pedaço para encaixar confortavelmente entre os cotos rostral e caudal de um lado da medula espinhal. Coloque um segundo segmento ao lado do primeiro segmento enxertadas, apposed para o outro lado da medula espinhal. Sutura da dura fechado sobre os enxertos implantados e tampa dura com uma pequenapedaço de membrana silastic.
- Músculos próximos em camadas com fio de sutura 4-0 e incisão na pele estreita com grampos de sutura.
- Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo.
Dia 3
- Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). Cortar suturas superficiais para expor silastic membrana que cobre o local do enxerto. Não perturbe o enxerto, mas sim expor a medula espinhal caudal ao enxerto e use uma seringa Hamilton com puxada de vidro cânula para microinject 1μl de condroitinase ABC em cada lado da medula espinhal de cerca de 1 mm distal à aposição de enxerto a medula espinhal.
- Fechar músculos superficiais com 4-0 ea incisão na pele com clipes ferida. Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. Realizar estimulação eletrofisiológica e registro e rotulagem, conforme descrito no tracer 5) e 6) acima.
8) Resultados Representante
Quando este procedimento é otimizado o segmento de nervo periférico de perto integrar-se com o cabo de anfitrião espinhal. Subindo e descendo os axônios da coluna vertebral vai entrar no enxerto, crescer em uma linha paralela relativamente simples para o comprimento do enxerto e se estendem até a extremidade distal do enxerto a uma taxa de aproximadamente 1 mm por dia. Ao chegar à extremidade distal, os axônios penetram no fio adjacente espinhal se condroitinase tem sido usado para remover proteoglicanos inibitória do tecido cicatricial ao redor. Conectividade funcional será determinada pela detecção eletrofisiológicos e imunocitoquímicos de uma resposta por neurônios da medula espinhal para a estimulação dos axônios dentro do enxerto. Correlação anatômica para a recuperação funcional será avaliado, traçando o número eo comprimento dos axônios que se estenderam além do enxerto de nervo de volta para a medula espinhal.
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Discussion
- Para a reprodutibilidade do experimento é importante que o nível de lesão da medula espinhal ser consistente de animal para animal. Por isso, é fundamental que o processo adequado vertebral para laminectomia ser identificado. Como estamos usando um modelo de lesão ou hemissecção transecção para este estudo não há ambigüidade sobre o tamanho da lesão, ou se específicos tratos espinhais foram feridos ou poupados.
- É necessário que o nervo periférico ser pré-degenerado antes do transplante porque este inicia a digestão dos axônios periféricos para proporcionar espaço para axônios em regeneração para crescer e porque ativa as células de Schwann para produzir vários fatores neurotróficos que suportam o crescimento interno de axônios.
- Colocação inicial do corte as extremidades do enxerto ao tecido da medula espinhal deve ser feita com firmeza (sem danificar o enxerto) para otimizar o crescimento do axônio para dentro e fora do enxerto. Aposição direta do enxerto de nervo periférico para a medula espinhal e fixação do enxerto com sutura é crítica.
- Uso de condroitinase para modificar a matriz extracelular ao redor do local do enxerto é uma outra característica fundamental dessa experiência. Cicatrizes gliais formada em resposta à lesão medular é uma barreira estrutural e química para o crescimento axonal. Digestão condroitinase do conteúdo de proteoglicanos inibitória da cicatriz facilita a extensão de axônios em regeneração para dentro e para além do enxerto.
- Existem várias áreas para a possível alteração deste procedimento para melhorar o grau de crescimento axonal dentro e fora do enxerto de nervo periférico. Estamos experimentando com a entrega de fatores neurotróficos para o local de aposição entre o enxerto ea medula espinhal anfitrião para promover a resposta regenerativa dos axônios feridos. Um aumento dos fatores neurotróficos podem ser alcançados pela injeção de vetores virais para aumentar a produção local ou pela injeção de nanopartículas para a liberação gradual de fatores. Também estão examinando o papel do exercício na promoção da produção de fatores neurotróficos endógenos para facilitar o crescimento axonal. Além dos modelos de aspiração lesão descrita acima, temos desenvolvido um modelo de lesão cervical contusão e têm aplicado com sucesso a nossa abordagem do enxerto de nervo periférico para apoiar a regeneração axonal.
- Para todos os nossos estudos que empregam diversos exames para medir as mudanças no comportamento motor e sensorial após a lesão da medula espinhal e depois intra enxerto de nervos periféricos.
Significado:
Com a abordagem de enxerto de nervo periférico descrito acima, temos demonstrado que o motor do adulto e neurônios sensoriais irá regenerar seu processo de feridos axonal para longas distâncias, quando fornecido com um substrato adequado para o crescimento. Temos mostrado que essa abordagem pode ser realizada como uma estratégia de tratamento agudo ou atrasado e que ele pode ser aplicado com sucesso para pequenas (mouse, rato) e grandes (gato) animais experimentais. É importante que a atividade funcional de regenerar os axônios ser testado eo modelo de enxerto de nervo periférico fornece acesso relativamente fácil a todos os axônios bridging uma lesão na medula espinhal. Esta é uma evidente vantagem sobre outros métodos de transplante.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH / NINDS Grants NS26380 e NS55976, o Christopher e Dana Reeve Foundation e do Fundo de Daniel Heumann de Pesquisas da Medula Espinhal. A Drexel University College of Medicine Centro Spinal Cord Research fornece suporte para instalações do núcleo usada para concluir este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 silk suture | ArosSurgical | T5A10N10 | |
| 6-0 silk suture | McKesson | 2693 | |
| Ampicillin | McKesson | 483549 | |
| Antibody to cFos | Sigma-Aldrich | F7799 | |
| Biotinylated dextran Amine | Invitrogen | D7135 | |
| Buprenorphin (.3mg/ml) | McKesson | 12496075701 | |
| Chondroitinase ABC | Associates of Cape Cod | 100332-1A | |
| Euthasol | Webster Veterinary | 07-805-9296 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-021-CV | |
| Isoflurane | Henry Schein | 209-1966 | |
| Michel Wound Clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Neurotrace Kit | Invitrogen | N7167 | |
| True Blue | Sigma-Aldrich | T5891 | |
| Xenodine | Webster Veterinary | 92201 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Forced Exercise Wheel | Lafayette Instruments | ||
| TreadScan System | Clever System | ||
| Infinite Horizon Impact Device | Precision Systems and Instrumentation | ||
| Magnetic Stimulation Device | Magstim |
References
- Houle, J. D. Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts. Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).
- Ye, J. H., Houle, J. D. Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons. Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).
- Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord. J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).
- Tom, V., Houle, J. D. Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft. Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).
