Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d'îlots humains
Summary
Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d'îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.
Abstract
Gestion diabète de type 1 est lourde, tant pour l'individu et la société, ce qui coûte plus de 100 milliards de dollars annuellement. Malgré l'utilisation répandue de la surveillance du glucose et des préparations d'insuline nouvelles, de nombreuses personnes encore développer des complications secondaires dévastateurs. Transplantation d'îlots pancréatiques peut restaurer à proximité de contrôle de la glycémie normale chez les patients diabétiques<sup> 1</sup>, Sans courir le risque d'épisodes hypoglycémiques graves qui sont associées à une insulinothérapie intensive. Fournir la masse des îlots suffisant est important pour la transplantation d'îlots de succès. Cependant, les caractéristiques des donneurs, le prélèvement d'organes et de la préservation affecter le résultat d'isolement<sup> 2</sup>. À l'Université de l'Illinois à Chicago (UIC), nous avons développé un protocole d'isolement de succès avec un gradient de purification améliorée<sup> 3</sup>. Le programme a démarré en Janvier 2004 et plus de 300 isolements ont été effectuées jusqu'à Novembre 2008. Le pancréas ont été envoyés dans les solutions de conservation par le froid (UW, Université du Wisconsin ou de HTK, histidine-tryptophane cétoglutarate)<sup> 4-7</sup> À l'isolement des cellules en laboratoire à l'UIC pour l'isolement des îlots. Les îlots pancréatiques ont été isolés en utilisant la méthode de l'UIC qui est une version modifiée de la méthode initialement décrite par Ricordi<em> Et al</em><sup> 8</sup>. Comme décrit dans la Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques, le pancréas humain était paré, perforée, perfusé, et digéré. Après la collecte et au moins 30 minutes d'incubation dans la solution UW, le tissu a été chargé dans le séparateur de cellules (COBE 2991, Cobe, Denver, CO) pour la purification<sup> 3</sup>. Après purification, le rendement des îlots (exprimés en équivalents îlot, IEQ), le volume des tissus, et la pureté a été déterminée selon les méthodes standard<sup> 9</sup>. Îlots isolés ont été cultivés dans CMRL-1066 médias (Mediatech, Herndon, VA), complété avec 1,5% d'albumine humaine, 0,1% d'insuline-transferrine-sélénium (STI), 1 ml de ciprofloxacine, 5 ml de HEPES 1M, et 14,5 ml de Bicarbonate de sodium 7,5% en T175 flacons à 37 ° C la nuit avant de la culture des îlots ont été transplantés ou utilisés pour la recherche.
Protocol
Discussion
En dépit des progrès significatifs dans les techniques d'isolement d'îlots humains, le rendement des îlots restent très variable et imprévisible. Purification du tissu pancréatique digérée est crucial de récupérer une masse suffisante Isle après digestion enzymatique de succès pour la transplantation. Le procédé de purification UIC est recommandée, car une reprise supérieure de très grande pureté îlots humains a été démontré en utilisant cette méthode. Par ailleurs, jusqu'à 50 ml de…
Acknowledgements
Soutenu par la fondation de l'Université de l'Illinois à Chicago ainsi que des cellules des îlots Resource Center subvention du NIH (RFA-05-003 RR), la Fondation Christopher, la Fondation Efroymson, et la Fondation Tellabs.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
Referências
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
