תרבויות ראשונית של<em> Aplysia</em> חושית מוטורית נוירונים לספק הכנת מודל לחקר היווצרות הסינפסה ואת הפלסטיות הסינפטית<em> במבחנה</em>. וידאו זה מדגים את זיהוי microdissection של נוירונים החושי והמוטורי מ<em> Aplysia</em> הגרעינים, כמו גם את השיטות לקביעת ושמירה על חושית, מוטורית נוירונים בתרבית.
מערכת העצבים של רכיכה ימית Aplysia californica היא פשוטה יחסית, בהיקף של כ -20,000 נוירונים. הנוירונים הם גדולים (עד 1 מ"מ קוטר) לזיהוי, עם גדלים, צורות שונות, עמדות pigmentations, ואת גופי התא נחשפים מבחוץ בגרעיני five לזווג מופץ בכל רחבי הגוף של החיה. תכונות אלו אפשרו לחוקרים לשרטט את המעגלים החשמליים הבסיסיים התנהגויות ספציפיות החיה 1. הקשר בין הנוירונים monosynaptic החושי והמוטורי היא מרכיב מרכזי של רפלקס הזימים-הנסיגה בשנת החיה, רפלקס הגנתי פשוט שבו החיה תיסוג הזימים שלו בתגובה לגירוי חוש המישוש של הסיפון. רפלקס זה עובר צורות של למידה בלתי אסוציאטיביים אסוציאטיבי, כולל רגישות, התרגלות ועל התניה קלאסית. תועלת מיוחדת ללימוד הפלסטיות הסינפטית, בסינפסה חושית מוטורית ניתן מחדש בתרבות, שם היטב מאופיין גירויים להפיק צורות פלסטיות כי יש מקבילות ישיר בהתנהגות של החיה 2,3. באופן ספציפי, יישום של סרוטונין מייצרת חיזוק הסינפטי, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, נמשך דקות (לטווח קצר סיוע), שעות (טווח ביניים סיוע) או ימים (לטווח ארוך סיוע). לעומת זאת, יישום FMRFamide את המשדר פפטיד מייצרת היחלשות דיכאון סינפטיים או, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, יכול להימשך בין דקות יום (לטווח ארוך דיכאון). גודל גדול של נוירונים מאפשר הקלטה חזר אלקטרודה חדה של חוזק סינפטי על פני תקופות של ימים יחד עם microinjection של וקטורים הביטוי, siRNAs ותרכובות אחרות למקד מפלי איתות ספציפיים מולקולות ובכך לזהות את השלבים ביולוגי מולקולרית של התא העומדים בבסיס השינויים ביעילות סינפטית.
יתרון נוסף של מערכת התרבות Aplysia נובעת מהעובדה כי הנוירונים סינפסה להפגין-סגוליות בתרבות 4,5. לפיכך, עצב סנסורי לא יוצרים סינפסות עם עצמם (autapses) או עם עצב סנסורי אחרים, ואין הם יוצרים סינפסות עם יעד שאינו הנוירונים המנוע מזוהה בתרבות. ורידים, אתרים של הקשר הסינפטי בין הנוירונים החושי והמוטורי, הם גדולים מספיק (2-7 מיקרון בקוטר) כדי לאפשר היווצרות הסינפסה (כמו גם שינויים במורפולוגיה הסינפטי) עם הנוירונים המנוע היעד להיחקר ברמה המיקרוסקופית אור.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת חושית מוטורית תרבויות נוירון, כולל הרדמה מבוגר ו Aplysia נעורים, לנתח הגרעינים שלהם, העיכול פרוטאז של הגרעינים, הסרת רקמת החיבור ידי microdissection, זיהוי של שני נוירונים החושי והמוטורי והסרה של כל סוג תא ידי microdissection, ציפוי של הנוירון המוטורי, תוספת של הנוירון מניפולציה חושית של neurite החושי כדי ליצור קשר עם תרבות מוטורית נוירון.
הכנה מוצלחת של Aplysia חושית מוטורית תרבויות יש עקומת למידה איטי במקצת, שכן הוא כרוך בפיתוח המוטוריקה העדינה קשורה microdissection ומניפולציה של נוירונים בודדים נצפים מבעד למיקרוסקופ, סטריאו. מניסיוננו, זה לוקח כ 1-3 שבועות של תרגול כדי להשיג בריא עצב סנסורי בודד בתרבות 1-3 ש…
עבודה במעבדה מעורבים culturing של Aplysia נוירונים ממומנת על ידי רשימה NIH R01 ו-NIH R21MH077921.
Solutions needed for culture
L-15 powder | 13.8g |
NaCl | 15.4 g |
D-Glucose | 6.24 g |
MgSO47H20 | 6.45g |
KCl | 350 mg |
NaHCO3 | 170 mg |
MgCl26H2O | 5.49 g |
CaCl22H2O | 1.43g |
HEPES | 3.53g |