בסרט זה אנו מציגים את<em> לשעבר vivo</em> דור והרחבת CD40 המופעל בתאים אנושיים B (CD40-B) מתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) על ידי גירוי עם ליגנד CD40 ו – interleukin-4.
CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) זוהו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור חיסוני סרטן 1-3. לעומת תאים דנדריטים (DCS), APC מאופיין הטובה ביותר, תאים CD40-B יש מספר מאפיינים ביולוגיים טכני מובהק. בדומה DCs, תאים B להראות ביטוי מוגבר של MHC ושיתוף גירוי מולקולות (Fig.1b), מפגינים יכולת הנדידה חזק מצגת להציג ביעילות אנטיגן ותאי T, לאחר גירוי עם ליגנד interleukin-4 ו CD40 (CD40L). עם זאת, בניגוד DCs בוגר או בוגרת, CD40 בתאי B-לבטא את לימפה הצומת השלישיה ביות מלא המורכב CD62L, CCR7/CXCR4, ותפקוד ליקוציט אנטיגן-1 (LFA1, CD11a/CD18), הכרחי ביות הלימפה לאיברים משני (Fig.1a) 3. תאים CD40-B יכול להיווצר ללא קשיים של כמויות קטנות מאוד של דם היקפיים אשר ניתן להרחבה נוספת במבחנה על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים סרטניים (> 10 9 תאים לכל מטופל) מתורמים בריאים, כמו גם חולים (Fig.1c, ד) 1,4.
בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו CD40-B תאים PBMC האדם. מולקולות מרכזיות בתרבות התא CD40 ליגנד, interleukin-4 (IL-4) ציקלוספורין A (CSA), אשר מתחדש בכל יום מחזור 3-4 התרבות. לענין מעבדה CD40 גירוי מסופק על ידי תאים NIH/3T3 להביע רקומביננטי אנושי CD40 ליגנד (tCD40L NIH/3T3) 5. כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 האדם על transfectants יש להיבדק באופן קבוע (Fig.2).
לאחר 14 ימים CD40-B בתרביות תאים מורכבים יותר טהור 95% תאים B ו הרחבה של CD40-B תאים מעל 65 ימים ניתן לעתים קרובות ללא כל אובדן של 1 לתפקד, 4. תאים CD40-B ביעילות לקחת, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T 6. הם לא רק naϊve הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון בתאי T 7,8. CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell, הפעלת התמיינות ותפקוד. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור חיסון או טיפול מונע נגד גידולים 9.
A. Preparation of Media:
Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
DMEM-Ham’s / F12 | DMEM-Ham’s / F12 | ||
L-Glutamine | 365 μg/mL | L-Glutamine | 365 μg/mL |
FBS | 10 % | FBS | 10 % |
HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
G-418 | 0.7 mg/mL |
CD40-B washing medium | CD40-B culture medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
IMDM | |
IMDM | |
L-Glutamine | 584 μg/mL | L-Glutamine | 584 μg/mL |
HEPES | 25 mM | HEPES | 25 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
rh Transferrin | 50 μg/mL | ||
rh Insulin | 5 μg/mL | ||
AB-Humanserum | 10 % |
B. Miscellaneous Reagents:
Reagent | Company | Order No |
DMEM / Ham’s F12 | PAA | Cat No: E15-813 |
IMDM | Invitrogen Gibco® | REF 21980-032 |
Dulbecco’s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 |
holo-Transferrin human | Sigma | Cat No T0665 |
Insulin human | Sigma | Cat No I2643 |
Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 |
Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
G-418 Sulphate | PAA | Cat No P02-012 |
Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
Reagent | Company | Order No |
Sterile pipette tips | Sarstedt | |
6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
Tissue culture flask | SARSTEDT | Cat No 83.1813.002 |