ヒトCD40活性化B細胞の生成

Summary

このビデオでは、提示<em>生体外で</emヒトCD40活性化B細胞（CD40 – B）CD40リガンドとインターロイキン-4で刺激による末梢血単核細胞（PBMC）からの>生成と展開。

Abstract

CD40活性化B細胞（CD40 – B細胞）癌免疫療法^1-3免疫刺激抗原提示細胞（APC）の代替源として同定されている。樹状細胞（DC）、最も特徴的なAPCに比べて、CD40 – B細胞は、いくつかの異なる生物学的および技術的な性質を持っている。樹状細胞と同様に、B細胞はMHCと共刺激分子（図1b）の発現増加を示す、インターロイキン4およびCD40リガンド（CD40L）による刺激の後、強い遊走能と効率的にT細胞に存在する抗原提示を示す。しかし、未成熟または成熟DCとは対照的に、CD40 – B細胞はCD62L、CCR7/CXCR4から成る完全なリンパ節ホーミングトライアドを表現し、二次リンパ器官へのホーミングに必要な白血球機能抗原-1（LFA1、CD11a/CD18）、 （図^1A）3。 CD40 – B細胞は、さらに高純度のCD40 – B健康なドナーからの細胞（患者あたり> 10 ⁹細胞）だけでなく、癌の非常に大量にin vitroで拡張することができる末梢血中の非常に少量から困難なしで生成することができます。患者^{（Fig.1c、D）1,4。}

このプロトコルでは、ヒトPBMCから完全に活性化されたCD40 – B細胞を取得する方法を示します。細胞培養のための重要な分子は、CD40リガンド、インターロイキン-4（IL – 4）とシクロス​​ポリン（CSA）、3〜4日の文化のサイクルで補充されている。です。実験の目的のためにCD40刺激は、組換えヒトCD40リガンドを発現NIH/3T3細胞（tCD40L ^NIH/3T3）5によって提供されます。非トランスフェクト細胞の混入を避けるために、トランスフェクタントでヒトCD40リガンドの発現は、（図2）定期的にチェックする必要があります。

14日後にCD40 – B細胞の培養は、65日間にわたって95％以上の純粋なB細胞とCD40 – B細胞の増殖から構成されて関数^1、4のいずれかを失うことなく頻繁に可能です。 CD40 – B細胞は、効率的に、プロセスを占有し、T細胞に存在する抗原^6。彼らだけでなく、素数ナイーブを行うだけでなく^、7,8メモリーT細胞を展開します。 CD40活性化B細胞はB細胞の活性化、分化と機能を研究するために使用することができます。また、彼らは腫瘍⁹に対する治療または予防接種のための有望なツールを表しています。

Protocol

パートプレート結合フィーダー細胞として使用されるNIH/3T3細胞を発現するCD40リガンドの準備を示しています：PBMCからヒトCD40活性化B細胞を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています。パートBは、実際のCD40 – Bの文化を説明します。 フィーダー細胞のA.準備（tCD40L NIH/3T3） tCD40L NIH/3T3は完全にコンフルエントになることはありません接着?…

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium		Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
DMEM-Ham’s / F12		DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine	365 μg/mL	L-Glutamine	365 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		G-418	0.7 mg/mL

CD40-B washing medium		CD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
IMDM		IMDM
L-Glutamine	584 μg/mL	L-Glutamine	584 μg/mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		rh Transferrin	50 μg/mL
		rh Insulin	5 μg/mL
		AB-Humanserum	10 %

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
DMEM / Ham’s F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco®	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma	Cat No T0665
Insulin human	Sigma	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	SARSTEDT	Cat No 83.1813.002