Geração de humanos CD40-activated células B

Summary

Neste vídeo, apresentamos a<em> Ex vivo</em> Geração e expansão de células CD40-activated B (CD40-B) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de estimulação com CD40 ligante e interleucina-4.

Abstract

Células CD40-activated B (CD40-células B) foram identificados como uma fonte alternativa de imuno-estimulatórias células apresentadoras de antígenos (APC) para imunoterapia de câncer ^1-3. Em comparação com as células dendríticas (DCs), a melhor caracterizada APC, as células CD40-B têm várias propriedades biológicas distintas e técnicos. Semelhante ao DCs, as células B mostram um aumento da expressão de MHC e moléculas co-estimulatórias (Fig.1b), apresentam uma forte capacidade migratória e apresentação de antígenos presentes de forma eficiente para células T, após a estimulação com a interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L). No entanto, em contraste com DCs imaturas ou maduro, as células CD40-B expressar a tríade completa nó de linfa homing consistindo de CD62L, CCR7/CXCR4 e função antígeno leucocitário-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessário para homing para órgãos linfóides secundários (Fig.1a) ^3. Células CD40-B pode ser gerado sem dificuldades a partir de quantidades muito pequenas de sangue periférico que pode ser expandida in vitro de quantidades muito grandes de alta-pura-B CD40 células de câncer (> 10 ⁹ células por paciente) de doadores saudáveis, bem como pacientes (Figura 1C, d) ^1,4.

Neste protocolo que demonstrar como obter totalmente ativado CD40-B a partir de células PBMC humana. Moléculas-chave para a cultura de células são CD40 ligante, a interleucina-4 (IL-4) e ciclosporina A. (CsA), que são reabastecidos em um ciclo de 3-4 dias de cultura Para fins de laboratório CD40-estimulação é fornecida por células que expressam NIH/3T3 recombinante ligante CD40 humano (tCD40L NIH/3T3) ^5. Para evitar a contaminação com os não-transfectadas células, a expressão do ligante CD40 humano no transfectants tem de ser verificados regularmente (Fig.2).

Após 14 dias CD40-B culturas de células consistem de mais de 95% de células B puro e uma expansão de células CD40-B com mais de 65 dias é frequentemente possível, sem qualquer perda de função de ^{1, 4.} Células CD40-B de forma eficiente recolher, processar e apresentar antígenos às células T ^6. Eles não só naϊve prime, mas também expandir células T de memória ^7,8. Células CD40-B ativado pode ser usado para estudo de células B ativação, diferenciação e função. Além disso, eles representam uma ferramenta promissora para a vacinação preventivo ou terapêutico contra tumores ^9.

Protocol

O protocolo para a geração de células CD40-activated B da CMSP é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação de CD40 ligante expressar NIH/3T3 células, que serão usados ​​como células da placa-bound alimentador. Parte B descreve a cultura CD40-B real. A. Preparação de células alimentadoras (tCD40L NIH/3T3) O NIH/3T3 tCD40L é uma linha de células aderentes murino de fibroblastos, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As c?…

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium		Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
DMEM-Ham’s / F12		DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine	365 μg/mL	L-Glutamine	365 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		G-418	0.7 mg/mL

CD40-B washing medium		CD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
IMDM		IMDM
L-Glutamine	584 μg/mL	L-Glutamine	584 μg/mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		rh Transferrin	50 μg/mL
		rh Insulin	5 μg/mL
		AB-Humanserum	10 %

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
DMEM / Ham’s F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco®	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma	Cat No T0665
Insulin human	Sigma	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	SARSTEDT	Cat No 83.1813.002